糖化酶活力实验结果-生物化学实验指导

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定过剩的碘，计算出酶活力。糖化酶活力测定中应注意哪些因素？

【目的要求】

1.学习测定糖化酶活力的基本原理和操作方法。

2.掌握测定酶活力的一般操作程序及要领。

【实验原理】

糖化酶（淀粉-葡萄糖苷酶EC3.2.1.3），广泛分布于能直接以淀粉为营养源的所有生物体中。糖化酶催化淀粉水解，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定过剩的碘，计算出酶活力。

1.葡萄糖分子中的醛基被碘氧化

2.过剩的碘与氢氧化钠作用，生成次碘酸钠

I₂+2NaOH—→NaOI +NaI +H₂O

3.加酸后次碘酸钠和碘化钠作用析出游离碘

NaOI +NaI +H₂SO₄—→I₂+Na₂SO₄+H₂O

4.用硫代硫酸钠标准液滴定过剩的碘

I₂+2Na₂S₂O₃—→Na₂S₄O₆+2NaI

通过滴定时所消耗的Na₂S₂O₃的量，可以得出糖化酶催化淀粉水解后所产生的葡萄糖的量，根据公式可计算出糖化酶的活力。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）0.1mol/L pH4.6乙酸缓冲液称取乙酸钠（NaAc·3H₂O）6.7g，溶于水中，加冰乙酸2.6mL，调至pH4.6，用水稀释至1000mL。

（2）0.05mol/L Na₂S₂O₃标准溶液称取13g硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃·5H₂O）和0.2g Na₂CO₃，用新煮沸过的冷水溶解并稀释至1000mL，配制一周后用碘酸钾标定。

（3）0.1mol/L碘溶液称取36g碘化钾溶于100mL水中，加入14g碘逐渐溶解，加3滴盐酸，用水稀释至1000mL，棕色瓶保存。

（4）1mol/L H₂SO₄溶液量取浓硫酸5.6mL，缓慢注入80mL水中，冷却后稀释至100mL。

（5）0.1mol/L NaOH溶液。

（6）2%可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至100mL，此溶液需当天配制。

（7）20% NaOH溶液。

2.器材

恒温水浴锅；电子天平；试管及试管架；吸量管；旋涡混合器；比色管（50mL）；碱式滴定管（25mL）；碘量瓶。(www.chuimin.cn)

【操作方法】

1.待测酶液的制备

称取酶粉1～2g，准确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入适当的容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。四层纱布过滤，滤液供测定用。

2.酶活力测定

于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25mL和pH4.6乙酸缓冲液5mL，混匀，置40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2mL，立刻混匀，在此温度下准确反应30min，立即各加20% NaOH溶液0.2mL，混匀。将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2mL，混匀。吸取上述反应液各5mL，分别置于碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘溶液10mL，再加0.1mol/L NaOH溶液15.0mL。摇匀，密塞，于暗处反应15min。取出，加1mol/L H₂SO₄溶液2mL，立即用0.05mol/L Na₂S₂O₃标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。

3.结果计算

酶活单位定义：在上述条件（40℃，pH4.6）下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

式中 A——空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；

B——样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；

c——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；

90.05——与1.00mL1mol/L硫代硫酸钠标准溶液相当的葡萄糖的质量，g；

32.2——反应液的总体积，mL；

5——吸取反应液的体积，mL；

1/2——吸取酶液2.00mL以1.00mL计；

n——酶液稀释倍数；

2——反应30min，换算成1h的酶活力系数。

所得的结果取整数表示。