实验：糖化酶分离纯化方法

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养源的所有生物体中。糖化酶的分离纯化实质是活性蛋白质的提纯过程。实验中选用工业糖化酶粗粉为原料。经离心分离获得的沉淀部分即为糖化酶的粗制品。经盐析法初步分离的糖化酶溶液含有大量的硫酸铵，会妨碍酶的进一步纯化，因此必须去除。脱盐后的糖化酶溶液经等电点沉淀、有机溶剂沉淀等处理可得到较纯的酶制剂。合并经检查不含的各管收集液，即为脱盐后的糖化酶液。

【目的要求】

1.了解并熟悉盐析和分子筛凝胶过滤层析法分离纯化糖化酶的原理和方法。

2.掌握有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法制备糖化酶的基本方法。

【实验原理】

糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养源的所有生物体中。该酶能将淀粉几乎百分之百地水解为葡萄糖，已广泛应用于淀粉糖浆及葡萄糖的工业生产。

糖化酶的分离纯化实质是活性蛋白质的提纯过程。实验中选用工业糖化酶粗粉为原料。首先加入一定比例的蒸馏水将酶浸出，离心后除去杂质，所得滤液为酶浸出液。然后在浸出液中加入70%饱和度的硫酸铵，使糖化酶沉淀析出。经离心分离获得的沉淀部分即为糖化酶的粗制品。经盐析法初步分离的糖化酶溶液含有大量的硫酸铵，会妨碍酶的进一步纯化，因此必须去除。常用的有透析法、凝胶过滤层析法等，本实验采用凝胶过滤层析法。

凝胶过滤层析法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差异除去粗制品中盐类。实验中先将盐析沉淀的糖化酶加水溶解，再将酶液通过Sephadex G-25凝胶柱，然后用蒸馏水洗脱。凝胶层析中由于酶蛋白的直径大于凝胶网孔，只能沿着凝胶颗粒间的空隙以较快的速度流过凝胶柱，所以最先流出柱外。而无机盐直径小于凝胶网孔，可自由进出凝胶颗粒的网孔，向下移动的速度慢，最后流出层析柱。这样经过凝胶层析后可以达到脱盐的目的（层析原理见图2-8示意图）。

脱盐后的糖化酶溶液经等电点沉淀、有机溶剂沉淀等处理可得到较纯的酶制剂。再用无水乙醇脱水、干燥，即得到较纯的干酶制剂。

【试剂与器材】

1.试剂、材料

（1）（NH₄）₂SO₄粉末。

（2）30%三氯乙酸溶液。

（3）葡聚糖凝胶G-25。

（4）糖化酶粗粉。

（5）95%乙醇。

（6）无水乙醇。

（7）奈氏试剂。

2.器材

层析柱（1.5cm×30cm）；电子天平；低速离心机；吸量管（2mL，5mL）；烧杯（150mL，500mL）；冰浴（冰袋）；精密pH试纸；黑瓷板；白瓷板。

【操作方法】

1.糖化酶的浸出

（1）称取2.0g糖化酶粗粉置于离心管中，加入20mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌15min。

（2）在天平上将离心管平衡，置于离心机中，4000r/min离心15min。弃去沉淀，上清液即为酶浸出液。(www.chuimin.cn)

2.硫酸铵盐析

（1）量出酶浸出液体积，称取（NH₄）₂SO₄粉末使达70%饱和度（472g/L），边加边搅拌缓慢加入到酶浸出液中，待（NH₄）₂SO₄全部溶解后室温下放置30min。

（2）4000r/min离心15min。弃上清液，沉淀即为盐析所得粗酶。加入4mL蒸馏水，溶解后滤纸过滤，备用。

3.凝胶柱层析脱盐

（1）凝胶的处理量取40mL SephadexG-25，倾入150mL烧杯中，加入2倍量的蒸馏水，置于沸水浴中1h，并经常摇动使气泡逸出。取出冷却，待凝胶下沉后，倾去含有细微悬浮物的上层液。

（2）装柱平衡选用1.5cm×30cm层析柱，垂直夹于铁架台上。层析柱滤板下必须充满水，不能留有气泡。向柱内加入少量水，将上述处理过的凝胶粒悬液连续注入层析柱内，直至所需凝胶床高度距层析柱上口3～4cm为止。装柱时凝胶床内不得有界面和气泡，凝胶床面应平整。打开下口夹，调节柱下口夹至流速2mL/min，用2倍柱床体积的蒸馏水平衡。关闭下口夹。

（3）上样与洗脱打开下口夹，使床面上的水流出（或用滴管吸出），待液面降到凝胶床表面时，关闭出水口。柱下面用10mL量筒接液，以便了解加样后液体的流出量。用滴管吸取盐析所得酶液，在距床面1mm处沿管内壁轻轻转动加入样品。然后打开下口夹，使样品进入床内，直到与床面平齐为止。立即用1mL水冲洗柱内壁，待水进入凝胶床后再加少量水。如此重复2次，以洗净内壁上的样品溶液。然后再加入适量水于凝胶床上，调流速10滴/min，开始洗脱。

（4）检测与蛋白质取黑白瓷板各一块，在黑瓷板凹孔内加1滴30%三氯乙酸溶液，检查流出液。待流出液出现白色浑浊或沉淀即示有蛋白质析出，立即用试管收集。每管收集2mL，直到无白色沉淀时停止收集。取1滴含有酶蛋白的各试管酶液于白瓷板凹孔中，加入1滴奈氏试剂，检查有无。合并经检查不含的各管收集液，即为脱盐后的糖化酶液。