生化实验：琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。本实验是利用丙二酸与琥珀酸的结构相似，故可以竞争性地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。表3-20 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制检测3.将各试管摇匀，并于液体上层滴加液体石蜡5滴，盖在液面上，以隔绝空气，置于37℃水浴中保温，随时观察各试管中美蓝的褪色情况，并记录时间。

【目的要求】

了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。

【实验原理】

某些物质在化学结构上与酶的底物相似，因而也能与酶的活性中心结合。当它的浓度增大时，就占据了酶的活性中心，使酶不能与底物结合，因而酶的活性受到抑制，这种抑制作用称为竞争性抑制。其特点是：抑制作用的强弱取决于抑制剂的浓度和底物浓度的相对比例，若底物浓度大，抑制剂的抑制作用就减弱，若抑制剂浓度大，抑制剂的抑制作用就增强。

本实验是利用丙二酸与琥珀酸的结构相似，故可以竞争性地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。

肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。在体内，琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸，脱下来的氢经一系列递氢体和递电子体，最后交给氧，生成水，同时放出大量能量，供机体利用。在体外实验，可以人为地使反应在无氧的条件下进行，反应中生成的FADH₂可使蓝色的美蓝（氧化型）还原为无色的美蓝（还原型），因此，可以从美蓝的褪色情况观察琥珀酸脱氢酶的作用。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）0.1mol/L Na₂HPO₄80.8mL和0.1mol/L KH₂PO₄19.2mL混合。

（2）0.04mol/L丙二酸钠溶液。

（3）0.02mol/L琥珀酸钠溶液。

（4）0.01%（质量浓度）美蓝溶液。

（5）生理盐水。

（6）液体石蜡。

2.器材

恒温水浴锅；手术剪；研钵；试管及试管架；刻度吸管；漏斗；脱脂棉；吸水纸；小白鼠（兔、蛙、鸡、猪）的肌肉。

【操作方法】(www.chuimin.cn)

1.取新杀死动物的肌肉3～5g，用冰冷的生理盐水洗2次，用吸水纸吸去水分，放于研钵中，在冰浴中剪碎，研磨成糜状，加冰冷的0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液10mL研磨成浆状，用少量脱脂棉过滤，即得肌提液（酶液），低温保存。

2.取试管3支，编号，按表3-20加入试剂。

表3-20 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制检测

3.将各试管摇匀，并于液体上层滴加液体石蜡5滴，盖在液面上，以隔绝空气，置于37℃水浴中保温，随时观察各试管中美蓝的褪色情况，并记录时间。

4.再次摇动试管，观察溶液颜色有何变化。

【要点提示】

1.酶液的提取需在冰浴中进行，以防酶失活。

2.丙二酸钠溶液、琥珀酸钠溶液亦可用丙二酸溶液、琥珀酸溶液代替。

3.本实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅速加入液体石蜡。

4.加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁加入，不要产生气泡。

5.加完液体石蜡后，在观察结果的过程中，不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝重新氧化变蓝。

【思考题】

1.为什么酶液的提取要在冰浴中进行？

2.为什么要在反应液的上面覆加液体石蜡？保温过程中为什么不能揺动试管？

3.各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？

生化实验：琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制

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