实验类型 验证性教学时数 3操作视频一、实验目的掌握酵母RNA提取的方法。RNA可溶于碱性溶液，用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，离心除去蛋白质和菌体后，上清液用乙醇沉淀，由此可得RNA的粗制品。RNA由核糖、碱基和磷酸组成，加入硫酸煮沸后可使其水解，从水解液中可对上述组分进行分别鉴定。向上述含有RNA的离心管内加10% H2SO45mL，加热煮沸1～2min，将RNA水解。......
2023-11-04
酵母RNA的提取、鉴定和测量方法
【摘要】：RN A在强酸和高温条件下可被降解为核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分。在RN A的含量测定中，采用紫外吸收的方法测定所提取的RN A的含量，同时分别于260nm和280nm处测出A值，可以鉴定RNA的纯度。称量所得RNA粗品质量。取水解液进行下列组分的鉴定。同时测定280nm波长处吸光值，计算A260与A280比值，鉴定所提取酵母RNA的纯度。
【目的要求】
1.学习稀碱法提取RN A的原理和操作方法。
2.了解核酸的组成，并掌握鉴定核酸组分的方法。
3.学习地衣酚显色法及紫外分光光度法测定RN A含量的原理及方法。
【实验原理】
酵母中RNA含量较高，占菌体质量的2.67%～10.0%，而干扰物质DNA的含量较少，仅占菌体质量的0.03%～0.516%，因此酵母是提取RNA较为理想的材料。
RN A可溶于稀碱溶液。在碱性提取液中，利用加热煮沸的方法使蛋白质变性，通过离心技术除去蛋白质。RNA溶液其pI较低，为2.0～2.5，利用RNA在乙醇中溶解度低的性质，加入酸性乙醇使RN A从溶液中沉淀出来，由此即可得到RN A的粗制品。
RN A在强酸和高温条件下可被降解为核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分。用硝酸银、地衣酚（3，5-二羟基甲苯）和定磷试剂可分别鉴定RN A水解液中嘌呤碱、核糖和磷酸等组分的存在。
定糖法：RN A分子中的核糖和浓盐酸（浓硫酸）作用脱水生成糠醛，糠醛与酚类化合物（地衣酚）在Fe3+或Cu2+催化下，缩合而生成鲜绿色复合物。
定磷法：强酸将核酸样品消化，使核酸分子中的有机磷转变为无机磷，无机磷与钼酸反应生成磷钼酸，磷钼酸在还原剂（抗坏血酸）作用下还原成钼蓝。
嘌呤的鉴定：嘌呤与硝酸银作用生成白色的嘌呤银沉淀。
在RN A的含量测定中，采用紫外吸收的方法测定所提取的RN A的含量，同时分别于260nm和280nm处测出A值，可以鉴定RNA的纯度。
【试剂与器材】
1.试剂、材料
（1）0.04mol/L NaOH溶液。
（2）95%乙醇。
（3）酵母粉。
（4）1.5mol/L H2SO4溶液。
（5）5%氨水。
（6）0.1mol/L AgNO3溶液。
（7）酸性乙醇溶液 10mL浓盐酸加到1000mL乙醇中混匀。
（8）FeCl3浓盐酸溶液 1mL10% FeCl3加到200mL浓盐酸中混匀。
（9）地衣酚（3，5-二羟基甲苯）—乙醇溶液 将6g地衣酚溶于100mL95%乙醇中，冰箱中保存。
（10）定磷试剂 A.17%H2SO4：将17mL浓硫酸缓缓加入83mL水中；
B.2.5%钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100mL水中；
C.10%抗坏血酸溶液：10g维生素C溶于100mL蒸馏水中，用棕色瓶贮存。
临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17%H2SO4∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸∶水=1∶1∶1∶2（体积比）。
2.器材
电子天平；紫外分光光度计；量筒（100mL）；布氏漏斗；低速离心机；吸量管（1mL）；三角瓶（250mL）；电磁炉；不锈钢锅。(www.chuimin.cn)
【操作方法】
1.酵母RN A提取
（1）称4g干酵母粉置于100mL三角烧瓶中，加入0.04mol/L NaOH溶液30mL，在沸水浴中加热30min，期间不时搅拌。
（2）冷却后转入离心管中，3500r/min离心10min。将上清液缓缓倾入20mL酸性乙醇溶液中，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3500r/min离心5min。弃去上清液。
（3）用95%乙醇洗涤沉淀，3500r/min离心5min。弃去上清液，再用10mL95%乙醇洗涤沉淀，离心（同上）5min，即得RNA粗制品。用无水乙醇将沉淀悬浮，3500r/min离心5min，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品质量。
代入公式计算含量：
2.酵母RNA组分的定性鉴定
利用离心管中残留的RNA进行定性鉴定。加1.5mol/L H2SO45mL，在沸水浴中加热10min使RNA水解，用流水冲洗管外冷却。取水解液进行下列组分的鉴定。
（1）嘌呤碱的鉴定 取2支试管，编号，按表3-12操作。观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀产生。静置15min后，再比较两管中的沉淀。
表3-12 嘌呤碱的鉴定
注：可用pH试纸检测加氨水后呈碱性的情况。
（2）核糖的鉴定 取2支试管，编号，按表3-13加入试剂。摇匀后于沸水浴中加热5min，观察两管颜色的变化。
表3-13 核糖的鉴定
（3）磷的鉴定 取试管2支，编号，按表3-14加入试剂。摇匀后于沸水浴中加热，观察两管颜色的变化。
表3-14 磷的鉴定
3.紫外吸收法测定RN A含量及纯度
准确称取RNA样品50mg，加少量0.01mol/L NaOH溶液调成糊状。加适量水，用5%氨水调至pH7.0，然后加水定容至50mL。取0.5mL，用水稀释至10mL。于紫外分光光度计260nm波长处测定吸光值，根据下列公式计算RNA含量。
式中 A260——260nm波长处吸光值；
L——比色杯的厚度，1c m；
0.024——每毫升溶液内含1μg RNA的A260值；
50——样品浓度，μg/mL。
同时测定280nm波长处吸光值，计算A260与A280比值，鉴定所提取酵母RNA的纯度。
【要点提示】
1.如果待测样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，需对样品进行处理后再测定其RN A含量。
2.RNA的260nm与280nm吸光度的比值在2.0以上，DNA的260nm与280nm吸光度的比值在1.8左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。
【思考题】
1.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？
2.RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？
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