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核酸含量测定-紫外吸收法-生物化学实验指导

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：核酸及其衍生物核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在260nm波长处。因此，测定未知浓度核酸溶液的A260值，即可计算出其中RNA或DNA的含量。通常蛋白质的最大吸收峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。选择厚度为1cm的石英比色杯，于紫外分光光度计上260nm波长处测定A值。

【目的要求】

1.学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量的原理及技术。

2.进一步熟悉紫外分光光度计的使用方法。

【实验原理】

核酸及其衍生物核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用ε（P）来表示，即每升含有1mol核酸磷的溶液在260nm波长处的吸光度（即A₂₆₀值）。RNA溶液（pH7.0）的ε（P）为7700～7800。RNA的含磷量约为9.5%，含1μg/mL RNA溶液的A₂₆₀为0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐溶液的ε（P）（pH7.0）为6600，DNA含磷量为9.2%，含1μg/mL DNA钠盐溶液的A₂₆₀为0.020。通常规定：在260nm波长下，浓度为1μg/mL的DNA溶液其吸光度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA溶液其吸光度为0.024。因此，测定未知浓度核酸溶液的A₂₆₀值，即可计算出其中RNA或DNA的含量。

蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的最大吸收峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.8左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）钼酸铵-过氯酸沉淀剂取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液。

（2）5%～6%氨水用25%～30%氨水稀释5倍。

（3）测试样品RNA或DNA干粉。

2.器材

紫外分光光度计；电子天平；低速离心机；吸量管（0.5mL，2mL）；试管及试管架；滤纸；擦镜纸；容量瓶（50mL）；冰袋（冰浴）。

【操作方法】

1.准确称取RNA或DNA样品0.50g，加少量0.01mol/L NaOH溶液调成糊状，再加适量水，用5%氨水调至pH7.0，然后加水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，于紫外分光光度计上260nm波长处测定A值。(www.chuimin.cn)

式中 A₂₆₀——260nm波长处吸光值；

n——稀释倍数；

L——比色杯的厚度，1c m；

0.024——每毫升溶液内含1μg RNA的A₂₆₀值；

0.020——每毫升溶液内含1μg DNA钠盐的A₂₆₀值。

2.如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm波长处A值作为对照。具体操作如下：

取2支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴中放置30min，以3000r/min离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。

【要点提示】

1.紫外分光光度计使用前要预热。

2.比色皿应成套使用，注意保护，不能拿在光面上。

3.离心机使用前必须将离心管平衡、对称放置。调速必须从低到高，离心结束等转子完全停下后，再打开盖子，然后将转速打到最低。

【思考题】

1.用该法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？

2.若样品中含有蛋白质，如何排除干扰？你认为最简便的方法是什么？