DNA含量测定实验结果

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，在595nm处有最大吸收，可用比色法测定。以DNA浓度μg为横坐标，A595为纵坐标，绘制标准曲线。根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量（μg）。

【目的要求】

1.掌握二苯胺显色法测定DNA含量的原理和方法。

2.熟悉可见分光光度计的使用以及标准曲线的制作。

【实验原理】

DNA酸解后生成嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸、磷酸和脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，在595nm处有最大吸收，可用比色法测定。其反应式如图3-14所示。

图3-14 脱氧核糖脱水生成蓝色化合物反应

样品中DNA浓度在40～400μg/mL范围内，吸光度与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）DNA标准溶液取小牛胸腺DNA以0.01mol/L NaOH溶液配制成200μg/mL的溶液。

（2）二苯胺试剂称取重结晶二苯胺1g，溶于100mL分析纯的冰醋酸中，再加入10mL过氯酸（60%以上）混匀，待用。使用前加入1mL1.6%乙醛溶液。所配得的混合液应为无色，贮于棕色瓶中。

2.器材

电子天平；可见分光光度计；恒温水浴锅；滤纸；吸量管（1mL，2mL，5mL）；试管及试管架；擦镜纸；研钵。

【操作方法】

1.DNA标准曲线的绘制

取6支试管，编号，按表3-11加入试剂。

表3-11 DNA标准曲线的绘制(www.chuimin.cn)

将上述各管置60℃恒温水浴中保温1h，冷却后于分光光度计595nm处比色。用0号管调零点，测出1～5号管吸光度。以DNA浓度μg为横坐标，A₅₉₅为纵坐标，绘制标准曲线。

2.待测样品的制备

将自制的DNA样品置于研钵中，加入少量0.01mol/L NaOH溶液，慢慢研磨使之溶解，然后以0.01mol/L NaOH溶液定容至50mL容量瓶中。

3.样品的测定

取2支试管，分别加入2mL待测液、4mL二苯胺试剂，摇匀。于60℃恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处比色。根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量（μg）。

4.计算

100g动物肝脏中DNA的含量：

式中 A——由标准曲线查得的样液中DNA的质量，μg；

n——样液的稀释倍数；

m——样品的质量，μg。

【要点提示】

如样品中含少量RN A时不影响测定，而蛋白质、某些糖及其衍生物、芳香醛和羟基醛等，都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定，测定前应尽量除去。

【思考题】

1.利用戊糖显色反应和紫外吸收测定核酸含量的方法，应用范围有何区别？

2.二苯胺法测定DNA含量时，若DNA样品中混有RNA或蛋白质、糖类时，是否会有干扰？