动物肝脏DNA提取实验

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：DNA与蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在。向溶液中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA制品。为了除去DNA中混杂的RNA，可用核糖核酸酶处理。此步的目的是使DNA与蛋白质分离。用玻棒沿同一方向慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上，晾干即为DNA产品。

【目的要求】

1.学习用盐溶液法从动物组织中提取DNA的原理和操作技术。

2.了解DNA和RNA的不同溶解性质。

【实验原理】

DNA与蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在。动植物的DNA核蛋白（DNP）能溶于水及高浓度的盐溶液（1mol/L NaCl），但在0.14mol/L NaCl的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白（RNP）则溶于0.14mol/L NaCl盐溶液。因此，利用不同浓度的NaCl溶液可将DNP和RN P从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的DNP用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开。加入氯仿-异戊醇可将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA制品。

为了防止DNA酶解，提取时加入乙二胺四乙酸（EDTA），以降低核酸酶的活性。为了除去DNA中混杂的RNA，可用核糖核酸酶处理。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）5mol/L NaCl溶液将292.3g NaCl溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。

（2）0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液将8.18g NaCl及37.2g EDTA溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。

（3）25% SDS溶液溶25g十二烷基硫酸钠于100mL45%乙醇中。

（4）氯仿-异戊醇混合液氯仿∶异戊醇=24∶1（体积比）。

（5）新鲜鸡肝脏（兔、猪、鼠均可）。

2.器材(www.chuimin.cn)

低速离心机；恒温水浴摇床；恒温水浴锅；组织匀浆器；手术剪刀；冰浴（冰袋）；刻度离心管；吸量管（0.5mL，2mL，5mL）。

【操作方法】

1.取新鲜动物肝脏4g，剪碎后置组织匀浆器中。加入8mL0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，研磨成匀浆。将匀浆转入刻度离心管中，4000r/min离心10min，弃去上清液。

2.沉淀中加入6mL0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，用玻璃棒搅拌，4000r/min离心10min，弃去上清液。该步骤重复2次，所得沉淀为DNP粗制品。

3.向沉淀中加入5mL0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，混匀后加入匀浆器中。滴加0.5mL25%SDS溶液，边加边搅拌。加毕，置60℃水浴中保温10min（不停搅拌）。溶液变得黏稠并略透明，取出冷却至室温。此步的目的是使DNA与蛋白质分离。

4.加入5mol/L NaCl溶液3mL，使NaCl最终浓度达到1mol/L。搅拌10min，使溶液变得黏稠并略带透明。

5.匀浆转入三角瓶中，加等体积的氯仿-异戊醇，放入水浴摇床中振摇20min。取出后3500r/min离心10min，此时离心管中出现三层，上层为含DNA的水液，中层为变性蛋白质，下层是氯仿-异戊醇。

6.吸出上层含DNA的水溶液（欲定量测定，必须用1mol/L NaCl洗2次，合并上清液），慢慢加入1.5～2倍体积的95%冷乙醇，DNA沉淀即析出。用玻棒沿同一方向慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上，晾干即为DNA产品。

【要点提示】

1.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，整个过程需在低温下进行。

2.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等，它们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚，并释放出核酸。

【思考题】

1.核酸提取中，除去杂蛋白的方法主要有哪几种？

动物肝脏DNA提取实验

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