柱层析分离血红蛋白-生物化学实验指导

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：凝胶柱层析又称分子筛层析，是对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。当MetHb混合液流过凝胶柱时，溶液中高铁血红蛋白由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙以较快的速度流过凝胶柱，最先流出层析柱。这样经过凝胶层析后即可除去高铁氰化钾，从而得到高铁血红蛋白纯品。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加入鸡血红蛋白样品0.5mL。

【目的要求】

1.掌握凝胶柱层析的基本原理。

2.学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子的实验技能。

【实验原理】

凝胶柱层析又称分子筛层析，是对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。层析所用的基质是凝胶颗粒，是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的高分子聚合物（图3-13）。每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，可让其在筛孔中自由扩散、渗透。当含有不同大小分子的混合物流经充满凝胶介质的层析柱时，小分子的物质能进入介质的孔隙，而大分子的物质则被排阻在介质之外，依此而达到分离的目的（见图2-8）。

图3-13 多孔网状结构的凝胶颗粒

血红蛋白（Hb）是红细胞的主要内含物，它是血红素和珠蛋白肽链连接而成的一种结合蛋白，属色素蛋白。在血红蛋白中（相对分子质量64500）加入过量的高铁氰化钾［K₃Fe（CN）₆，相对分子质量327.25］后，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。为了除去MetHb样品中多余的高铁氰化钾，将MetHb混合液通过交联葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25）柱，然后用磷酸缓冲液洗脱。当MetHb混合液流过凝胶柱时，溶液中高铁血红蛋白由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙以较快的速度流过凝胶柱，最先流出层析柱。实验中可观察到MetHb（红褐色）洗脱较快。而小分子的高铁氰化钾由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，向下移动的速率慢，所以，最后流出层析柱。这样经过凝胶层析后即可除去高铁氰化钾，从而得到高铁血红蛋白纯品。

【试剂与器材】

1.试剂、材料

（1）鸡抗凝全血取新鲜鸡血以1∶100的比例加入肝素钠，搅拌均匀。

（2）0.2mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）3.121g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL为A液；称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）7.164g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL为B液。取A液39mL、B液61mL，混匀后即成。

（3）0.02mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液量取0.2mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液100mL，加蒸馏水稀释至1000mL。

（4）四氯化碳（CCl₄）。

（5）生理盐水 0.9% NaCl溶液。

（6）葡聚糖凝胶G-25。

（7）0.4% K₃Fe（CN）₆溶液。

2.器材

低速离心机；可见分光光度计；刻度离心管；移液枪；电磁炉；层析柱（1.5cm× 20cm）；铁架台；培养皿；贮液瓶。

【操作方法】

1.凝胶的处理

量取30mL SephadexG-25，倾入150mL烧杯中，加入2倍体积的0.02mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液，置于沸水浴中1h，并经常摇动使气泡逸出。取出冷却，待凝胶下沉后，倾去含有细微悬浮物的上层液。(www.chuimin.cn)

2.装柱平衡

选用1.5cm×20cm层析柱，垂直夹于铁架台上。层析柱滤板下必须充满水，不能留有气泡。向柱内加入少量磷酸盐缓冲液，将上述处理过的凝胶粒悬液连续注入层析柱内，直至所需凝胶床高度距层析柱上口3～4cm为止。装柱时凝胶床内不得有界面和气泡，凝胶床面应平整。打开出口，调节柱下口夹至流速2mL/min，继续用2倍柱床体积的磷酸缓冲液平衡，最后关闭出口。

3.样品处理

（1）血红蛋白溶液的制备取加入肝素钠的鸡抗凝全血3mL于刻度离心管中，2500r/min离心5min。吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀，3000r/min离心5min。弃去上清液，重复操作洗2次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇，使细胞破裂。再加1/2体积CCl₄，用力振摇3min。溶出血红蛋白Hb，3000r/min离心5min。吸取上层澄清的血红蛋白液备用（4℃暂存）。

（2）鸡血红蛋白样品吸取血红蛋白液2滴、K₃Fe（CN）₆8滴和蒸馏水2滴，混合制成高铁血红蛋白（MetHb）混合样品。

（3）上样洗脱打开层析柱下口夹，使柱床面上的缓冲液流出。待液面降到凝胶床表面时，关闭出水口。在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加入鸡血红蛋白样品0.5mL。打开下口夹，使样品进入柱床内，直到与床面平齐为止。立即用1mL磷酸盐缓冲液冲洗柱内壁，待缓冲液进入凝胶柱床后再加少量缓冲液。如此重复2次，以洗净内壁上的样品溶液。加入适量缓冲液于凝胶床上（出现不同的色带），连接储液瓶进行洗脱。

4.分部收集

用小试管收集流出的液体，以10滴/min的流速收集，每管收集20滴。注意观察柱上的色带，待黄色的K₃Fe（CN）₆色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。

5.绘制洗脱图谱

将每管收集液加入0.02mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液4mL，混匀。于425nm波长处，以洗脱液作空白，测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。

【要点提示】

1.装柱时，不能有气泡和分层现象，凝胶悬液尽量一次加完。

2.流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。

3.在整个洗脱过程中，始终应保持层析柱床面上有一段水，不得使凝胶干结。

4.血红蛋白加入K₃Fe（CN）₆上柱后是砖红色，而未加K₃Fe（CN）₆的是鲜红色。

【思考题】

1.在向凝胶柱加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？

2.请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或者太慢？

3.某样品中含有1mg A蛋白（相对分子质量10000）、1mg B蛋白（相对分子质量30000）、4mg C蛋白（相对分子质量60000）、1mg D蛋白（相对分子质量90000）和1mg E蛋白（相对分子质量120000），采用SephadexG-75（排阻上下限为3000～70000）凝胶柱层析，请指出各蛋白的洗脱顺序。

柱层析分离血红蛋白-生物化学实验指导

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