生物化学实验指导：醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白成果

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化为乙酸酯溶于丙酮制成的。

【目的要求】

1.学习醋酸纤维素薄膜电泳原理。

2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白的操作技术。

【实验原理】

醋酸纤维素薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化为乙酸酯溶于丙酮制成的。薄膜具有均一细密泡沫状结构，厚度仅120μm，有很强的渗透性，对分子移动无阻力。

电泳是带电颗粒在电场中向其电荷相反方向的电极移动的现象。带电颗粒在电场中的移动方向和迁移速度取决于颗粒自身所带电荷的性质、电场强度、溶液的pH等因素。

血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等。各种蛋白质的等电点均低于pH7.0（表3-10），所以在pH8.6的缓冲液中都带负电荷，在电场中均向正极移动。由于血清中各蛋白等电点不同，在同一pH下所带电量不同，此外，各种蛋白质分子大小也不同，因此在电场中的泳动速度不同。这样可根据它们的泳动速度快慢不同将其分离开来。

表3-10 血清蛋白质中各组分的pI和相对分子质量

电泳后，用氨基黑10B溶液染色，经脱色液处理除去背景染料，透明后可显示5条区带。清蛋白泳动速度最快，其余依次为α₁-球蛋白、α₂-球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白。蛋白质含量可用分光光度计直接测定，或用洗脱法进行比色测定。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）新鲜血清无溶血现象。

（2）巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6离子强度0.075）称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，加蒸馏水加热溶解后稀释至1000mL。

（3）染色液称取氨基黑10B0.5g，加入蒸馏水40mL、甲醇50mL、冰醋酸10mL。

（4）漂洗液 95%乙醇45mL，冰醋酸5mL，蒸馏水50mL，混匀。

（5）透明甲液冰醋酸15mL，无水乙醇85mL，混匀。

（6）透明乙液冰醋酸25mL，无水乙醇75mL，混匀。

2.器材

电泳仪及电泳槽；直尺及铅笔；醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）；点样器；培养皿（染色及漂洗）；镊子；吹风机；滤纸及滤纸条；竹夹子。

【操作方法】

1.薄膜的处理

（1）取两条2cm×8cm的膜条，将薄膜无光泽面向下，放入盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，使膜条浸泡30min以上。

（2）待薄膜完全浸透后，用竹镊子轻轻取出（识别光泽面和无光泽面），将薄膜的无光泽面向上，平铺在滤纸上，再用一张滤纸吸去多余的液体。

（3）用铅笔在无光泽面膜条一端1.5cm处轻轻画一条线作为点样区。

2.点样(www.chuimin.cn)

将点样器在盛有血清的表面皿中蘸一下，再在点样区轻轻地垂直落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。点样是实验的关键，点样前可在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样（图3-10）。

3.电泳

（1）将薄膜点样面朝下平贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，注意薄膜中间不可出现凹面，点样端应置于阴极端（图3-11）。

图3-10 醋酸纤维素薄膜点样示意图

图3-11 醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图

（2）打开电源开关，调节电流0.4～0.6mA/cm膜宽，电泳时间50min左右。

4.染色与漂洗

电泳完毕，将薄膜取出，立即浸于染色液中，染色5min。取出后先用水冲去染液，再浸于漂洗液中脱色，每次约5min，待背景无色为止，用滤纸吸干薄膜。

5.结果判断

漂洗后，薄膜上可显现清楚的5条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α₁-球蛋白、α₂-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白（图3-12）。

图3-12 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图

1—清蛋白 2～5—α₁-球蛋白，α₂-球蛋白，β-球蛋白及γ-球蛋白 6—点样原点

6.薄膜透明

用滤纸吸干薄膜，放入透明甲液中2min，取出后立即放入透明乙液中1min（要准确）。迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡，5～10min薄膜完全透明。若透明太慢，可用透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂直放置。待其自然干燥或用吹风机冷风吹干且无酸味时，再将玻璃板放在自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将薄膜取下。用滤纸吸干所有的水分，压干。

此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描，长期保存不褪色。

【要点提示】

1.醋酸纤维素薄膜一定要完全浸透，如有任何斑点、污染或划痕，均不能使用。

2.取出浸泡后的醋酸纤维素薄膜后，用滤纸轻轻吸去缓冲液，以免引起样品扩散，但也不可太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不齐，影响分离效果。

3.薄膜点样面朝下平贴在“滤纸桥”上，点样端应置于阴极端。

【思考题】

1.为什么将薄膜的点样端放在滤纸桥的负极端？

2.用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？

3.电极缓冲液可重复使用多次，但重要的是，每次用过后要互换电极方向，为什么？