快速测定蛋白质浓度—实验11BCA法

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：一个Cu+螯合2个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿色变为蓝紫色，在562nm处有高的光吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。BCA法定量测定蛋白质含量与其他方法相比有何优点及缺点？

【目的要求】

1.了解BCA法测定蛋白质浓度的原理。

2.掌握BCA法测定蛋白质含量的方法。

【实验原理】

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法是Lowry测定法的一种改进方法，是近年来广为应用的蛋白质含量测定方法。

BCA及其钠盐是一种溶于水的化合物，与含有Cu²⁺的硫酸铜等其他试剂混合一起，即成为苹果绿色的BCA工作试剂。在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键能与Cu²⁺络合生成配位化合物，同时将Cu²⁺还原为Cu⁺。一个Cu⁺螯合2个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿色变为蓝紫色（图3-9），在562nm处有高的光吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

图3-9 BCA法反应过程

BCA法灵敏度高，BCA试剂测定范围是0.5～20μg/mL。

【操作方法】

1.试剂

（1）试剂 A：2%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.4%氢氧化钠、0.16%酒石酸钠、0.95%碳酸氢钠混合后，pH调至11.25。

试剂B：4%硫酸铜。

BCA工作试剂：试剂A∶试剂B为50∶1混合（BCA工作液室温24h内稳定）。

（2）蛋白标准液准确称取150mg小牛血清白蛋白溶于100mL生理盐水中。

（3）新鲜绿豆芽下胚轴。

2.器材

恒温水浴锅；试管及试管架；移液管；移液枪；分光光度计；研钵。

【操作方法】

1.蛋白质的提取

（1）准确称取新鲜绿豆芽下胚轴2.0g，放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆。(www.chuimin.cn)

（2）将匀浆转移至漏斗中过滤，用10～20mL蒸馏水分3次洗涤研钵，洗涤液过滤并收集其滤液。

（3）滤液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

2.标准曲线的绘制及样品蛋白质测定

取8支干净试管，编号，按表3-9加入试剂。

表3-9 标准曲线的绘制及样品蛋白质测定

【结果处理】

1.以蛋白质质量μg为横坐标，A₅₆₂为纵坐标绘制标准曲线。

2.取样品A₅₆₂平均值在标准曲线上查出相应的蛋白质质量（μg）。

3.计算绿豆芽中蛋白质含量。

式中 m₀——由标准曲线上查得的蛋白质的质量，μg；

1.0——吸取提取液体积，mL；

V——提取液总体积，mL；

m——称取试样质量，g。

【要点提示】

1.BCA法测定蛋白质浓度不受绝大部分样品中化学物质的影响，但螯合剂（EDTA、EGTA）、还原剂（DTT、巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。

2.待测样品稀释倍数要合适，测定其A₅₉₅应在0.20～0.70范围内。

【思考题】

BCA法定量测定蛋白质含量与其他方法相比有何优点及缺点？

快速测定蛋白质浓度—实验11BCA法

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