蛋白质含量测定：考马斯亮蓝染色法实验结果

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。该反应非常灵敏，最低检出量为1μg蛋白质，在1～1000μg蛋白质范围内呈良好的线性关系。于595nm波长处以0号管调零点，测定各管吸光度。计算绿豆芽中蛋白质含量。考马斯亮蓝G-250染色法定量测定蛋白质含量与其他方法相比有何优点及缺点？

【目的要求】

1.学习用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和操作方法。

2.熟悉可见分光光度计的使用方法。

【实验原理】

考马斯亮蓝G-250在磷酸溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰为595nm。考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

图3-8 考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合示意图

考马斯亮蓝G-250主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合，这种结合具有高敏感性。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，其结合物在室温下可保持稳定1h。该反应非常灵敏，最低检出量为1μg蛋白质，在1～1000μg蛋白质范围内呈良好的线性关系。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）考马斯亮蓝试剂称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，加蒸馏水稀释至1000mL。

（2）蛋白质标准溶液结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成100μg/mL的蛋白质标准溶液。

2.器材

可见分光光度计；电子天平；试管及试管架；滤纸；吸量管（0.5mL，1mL，5mL）；涡旋振荡器；容量瓶（50mL）；研钵；漏斗。

【操作方法】

1.蛋白质的提取

（1）准确称取新鲜绿豆芽下胚轴2.0g，放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆。

（2）将匀浆转移至漏斗中过滤，用10～20mL蒸馏水分3次洗涤研钵，洗涤液过滤并收集其滤液。

（3）滤液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。(www.chuimin.cn)

2.标准曲线的绘制及样品蛋白质测定