紫外吸收法快速测蛋白质含量

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：其中以核酸的影响较大，然而核酸的最大吸收峰是在260nm，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定A260与A280，然后根据两种波长的吸光度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比可减少非蛋白质成分引起的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

【目的要求】

1.了解紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。

2.掌握紫外分光光度计的使用方法。

3.掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的实验技术。

【实验原理】

蛋白质分子中所含酪氨酸、色氨酸残基的苯环含有共轭双键，它们具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰在280nm波长处，且在此波长内蛋白质溶液的A₂₈₀与其浓度成正比，故可作为蛋白质定量测定的依据。由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故如果要准确定量，必须要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或者已经知道其消光系数作为参考。

另外，不少杂质在280nm波长下也有一定吸收能力，可能发生干扰。其中以核酸的影响较大，然而核酸的最大吸收峰是在260nm，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定A₂₆₀与A₂₈₀，然后根据两种波长的吸光度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。

蛋白质的肽键在200～250nm有强的紫外吸收，其光吸收强度与一定范围的蛋白质浓度成正比，且波长越短光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比可减少非蛋白质成分引起的误差。

本法操作简便迅速，且不消耗样品（可以回收），低浓度的盐类不干扰测定，在生化研究中应用广泛，尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。该法可测定蛋白质范围在0.1～1mg/mL之间。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）蛋白质标准溶液称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，用蒸馏水配成1mg/mL的蛋白质标准溶液。

（2）待测蛋白质溶液称取牛血清蛋白，配成约1mg/mL的溶液。

2.器材

紫外分光光度计；试管及试管架；石英比色杯；擦镜纸；吸量管（0.5mL，1mL，2mL，5mL）；电子天平。

【操作方法】

1.标准曲线法

（1）标准曲线的绘制取8支干净试管，编号，按表3-7分别加入试剂。(www.chuimin.cn)