其中以核酸的影响较大，然而核酸的最大吸收峰是在260nm，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定A260与A280，然后根据两种波长的吸光度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比可减少非蛋白质成分引起的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。......
2023-11-06
福林酚法快速测蛋白含量
【摘要】：在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在650nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。该方法适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定，对含这两个残基的量与标准蛋白差异较大的蛋白质样品测定其含量有误差。福林-酚试剂法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的方法之一。本法适于测定蛋白质范围为25～250μg。
【目的要求】
1.了解福林-酚法测定蛋白质含量的原理。
2.学习测定样品蛋白含量的操作。
【实验原理】
福林-酚法测定蛋白质含量是双缩脲法的发展，较双缩脲法灵敏。所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物（福林-酚试剂），在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成蓝色的钨蓝和钼蓝。在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在650nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。
该方法适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定，对含这两个残基的量与标准蛋白差异较大的蛋白质样品测定其含量有误差。福林-酚试剂法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的方法之一。
本法适于测定蛋白质范围为25～250μg。该法的缺点是费时较长，标准曲线也不是严格的直线，专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如—CO—NH2—，—CH2—NH2，CS—NH2以及缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物都可干扰福林-酚反应。
【试剂与器材】
1.试剂
（1）福林-酚试剂甲 A.4%Na2CO3溶液；B.0.2mol/L NaOH溶液；C.1%CuSO4溶液；D.2%酒石酸钾钠溶液。
临用前将A与B等体积配制成Na2CO3-NaOH溶液。C与D等体积混合成CuSO4-酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50∶1的比例混合即成。此试剂临用前配制，1d内有效。
（2）福林-酚试剂乙 称取钨酸钠（NaWO3·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g置于2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL、磷酸50mL和浓盐酸100mL。充分混匀，接回流冷凝管，小火回流10h。回流结束后加入150g硫酸锂（LiSO4）、50mL蒸馏水及数滴液体溴，在通风橱中开口继续煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。将溶液稀释至1000mL，过滤，置棕色瓶中保存。使用时用水1∶2稀释。
（3）标准蛋白溶液 牛血清蛋白或酪蛋白预先经凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成250μg/mL溶液。
（4）待测蛋白样品 绿豆芽下胚轴。
2.器材
可见分光光度计；电子天平；擦镜纸；滤纸；吸量管（0.5mL，1mL，5mL）；旋涡混合器；低速离心机；漏斗；试管及试管架。
【操作方法】
1.样品液的制备
（1）准确称取新鲜绿豆芽下胚轴2.0g，放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆。
（2）将匀浆转移至漏斗中过滤，用10～20mL蒸馏水分3次洗涤研钵，过滤洗涤液并收集其滤液。
（3）滤液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。(www.chuimin.cn)
2.标准曲线制作及样品测定
取8支干净试管，编号，分别按表3-6加入试剂。
表3-6 标准曲线制作及样品测定
室温放置30min后将上述各管液体在分光光度计上650nm处比色。用0号管调零点，分别测定1～5号管吸光度。
【结果处理】
1.以蛋白质含量（μg）为横坐标，A650为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2.取样品A650平均值在标准曲线上查出相应的标准蛋白浓度。
3.计算所提取生物材料中蛋白质的含量。
式中 m0——由标准曲线查得的蛋白质的质量，μg；
1.0——吸取试样体积，mL；
V——试样总体积，mL；
m——称取试样质量，g；
1000——μg换算成mg的系数。
【要点提示】
1.待测样品稀释倍数要合适，测定其A650应在0.20～0.70范围内。
2.福林-酚乙试剂仅在酸性条件下较稳定，而福林-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当加入福林-酚乙试剂时，必须立即混匀，以便在福林-酚乙试剂被破坏之前能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
【思考题】
1.标准浓度蛋白质和样品蛋白质含量的测定为什么要同步进行？
2.福林-酚测定蛋白质的原理是什么？有哪些因素可干扰福林-酚测定蛋白含量？
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