双缩脲法测蛋白含量-生物化学实验指导

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应生成复杂的紫红色络合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸的组成无关。双缩脲法测定蛋白质的浓度范围为1～10mg/mL，常用于需要快速但并不需十分精确的测定。

【目的要求】

1.学习标准管法测物质浓度的方法。

2.掌握双缩脲法测蛋白含量的原理。

3.掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的方法。

【实验原理】

具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应生成复杂的紫红色络合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，在碱性溶液中也能与Cu²⁺络合成紫红色化合物，在540nm处有最大光吸收。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸的组成无关。

双缩脲法测定蛋白质的浓度范围为1～10mg/mL，常用于需要快速但并不需十分精确的测定。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）标准蛋白溶液（5mg/mL）准确称取已定氮的酪蛋白（干酪素或牛血清白蛋白）用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。

（2）双缩脲试剂溶解1.5g硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC₄H₄O₆· 4H₂O）于500mL蒸馏水中，在搅拌下加入300mL10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000mL，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。

（3）样品血清动物血清用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。

2.器材(www.chuimin.cn)

分析天平；分光光度计；恒温水浴箱；试管；吸量管。

【操作方法】

1.样品测定

用标准管法测定蛋白质含量。取四支试管按表3-5操作。

表3-5 吸光度测定

摇匀，37℃水浴20min后用分光光度计于540nm波长处比色，以空白管调零点，测得各管吸光度。

2.计算

血清总蛋白质（g/100mL）=A_测/A_标×0.005×100/0.1

【要点提示】

1.显色后30min内进行比色测定，各管由显色到比色的时间尽可能一致。

2.当有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊现象，加入乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清再测定。