微量凯氏定氮法测蛋白质含量

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：天然有机物的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。在凯氏定氮仪中，2SO4与浓碱作用可分解放出氨。最后根据所用标准盐酸的量计算出待测液中的总氮量，进而计算出样品中粗蛋白质含量。先用低温加热，不久看到凯氏烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，此时要注意控制火力，勿使瓶内泡沫上升至瓶颈，否则将会影响样品测定结果。

【目的要求】

1.学习微量凯氏定氮法的原理和操作技术。

2.掌握用此法测定生物材料的总氮量和蛋白质含量。

【实验原理】

天然有机物的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。

当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解产生NH₃、CO₂和H₂O。其中NH₃与硫酸化合生成（NH₄）₂SO₄，由大分子分解成小分子的过程通常称为消化。消化过程进行很慢，通常需要加入K₂SO₄提高消化液的沸点（消化液的沸点由290℃→400℃），加入CuSO₄作为催化剂，H₂O₂作为氧化剂，以促进反应的进行。在凯氏定氮仪中，（NH₄）₂SO₄与浓碱作用可分解放出氨。借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的H₃BO₃溶液中，H₃BO₃吸收氨后使溶液中的H⁺浓度降低，然后用标准盐酸溶液滴定，直至恢复溶液中原来的H⁺浓度为止。最后根据所用标准盐酸的量计算出待测液中的总氮量，进而计算出样品中粗蛋白质含量。

以蛋白质为例，其化学反应如下：

消化：蛋白质+H₂SO₄—→CO₂+SO₂+H₂O+NH₃

2NH₃+H₂SO₄—→（NH₄）₂SO₄

蒸馏：（NH₄）₂SO₄+2NaOH—→2H₂O+Na₂SO₄+2NH₃

吸收：2NH₃+4H₃BO₃—→（NH₄）₂B₄O₇+5H₂O

滴定：（NH₄）₂B₄O₇+2HCl+5H₂O—→2NH₄Cl+4H₃BO₃

【试剂与器材】

1.试剂

（1）消化液 30%H₂O₂与H₂SO₄与水的比例为3∶2∶1，即在1份水中缓慢加入2份H₂SO₄，待冷却后，将其加入到3份30%H₂O₂中，混合备用。此液存放阴凉处可保存一个月。

（2）混合指示剂贮备液取50mL0.1%甲基蓝无水乙醇溶液与200mL0.1%甲基红无水乙醇溶液，混合后贮于棕色瓶中备用。本指示剂在pH5.2时为紫红色，pH5.4时为暗灰色；pH5.6时为亮绿色，变色点pI为5.4，指示剂变色范围很窄，极其灵敏。

（3）硼酸指示剂混合液取2%H₃BO₃溶液100mL，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后，溶液呈紫红色即可（约加1mL指示剂）。

（4）混合催化剂硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）10g，硫酸钾100g，硒粉0.2g，在研钵中研细，使通过40目筛，混匀后备用。

（5）0.0100mol/L HCl标准溶液。

（6）40%NaOH溶液。

（7）标准（NH₄）₂SO₄溶液（0.3mg氮/mL）。

2.器材

微量凯氏定氮仪；三角瓶（100mL）；凯氏烧瓶（100mL）；电子天平；表面皿；量筒（10mL）；电炉；容量瓶（100mL）；微量滴定管（5mL）。

【操作方法】

1.消化

准确称取105℃烘至恒重的蛋白样品0.1g（精确到0.0001g），置于100mL凯氏烧瓶中。加1g混合催化剂、5mL消化液，同时作一对照，除不加试样外其他相同。摇匀后，将凯氏烧瓶放在通风橱内的消化炉上消化。先用低温加热，不久看到凯氏烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，此时要注意控制火力，勿使瓶内泡沫上升至瓶颈，否则将会影响样品测定结果。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解释出SO₂白烟后，适当加强火力，直至消化液透明，并呈淡蓝绿色为止。为了保证消化彻底，再继续加热10min。消化完毕，取出消化瓶冷却至室温，加水10～20mL，待溶液温度降到室温后，再转入100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀后准备蒸馏。

2.蒸馏

（1）凯氏定氮蒸馏仪（图3-7）的洗涤蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水，加热，使蒸汽发生器a中水沸腾。打开h、d使蒸汽通过b、c、d、f冲洗5min，然后关上d，使蒸汽通入接收器洗5min，然后开放冷凝水。在g处放一盛有5mL硼酸指示剂混合液的三角瓶，继续使蒸汽通过1～2min，观察三角瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。移去三角瓶，打开夹子i：夹紧夹子h，由于b瓶中蒸汽压力降低，使c中的液体倒流入b瓶中，打开b瓶下端活塞，将废液放出。(www.chuimin.cn)

图3-7 凯氏定氮蒸馏装置

a—蒸汽发生器 b—蒸汽收集器 c—反应室d—漏斗 e—玻璃管 f—冷凝管g—吸收瓶 h—铁夹 i—铁夹

（2）标准样品练习为了熟练蒸馏操作，可先用标准（NH₄）₂SO₄溶液试验3～5次。取3个100mL三角瓶，各加5mL硼酸指示剂混合液，用表面皿覆盖备用。

①加样。加样前反应室c内液体应尽量减少，以免降低碱的浓度使氨蒸馏得不完全。将1个盛有硼酸指示剂混合液的三角瓶放在冷凝管下，将瓶倾斜，使冷凝管下端浸在液体内。打开漏斗d夹子，用吸量管吸取1mL标准（NH₄）₂SO₄溶液，小心地加到漏斗下方，使其流入反应室c。用量筒量取40%NaOH溶液10mL放入漏斗d，轻轻开启夹子使之流入反应室，尚未完全流入时，将夹子夹紧，向漏斗中加入约5mL蒸馏水，再轻轻打开夹子，使一半蒸馏水流入反应室，一半留在漏斗中作水封。

②蒸馏。在进行上述加样操作时，蒸汽不能停，加样完毕，开始蒸馏，此时三角瓶内硼酸指示剂混合液由紫色变成鲜绿色，自变色起计时，蒸馏3～5min。移开三角瓶，使硼酸液离开冷凝管口约1cm，用少量蒸馏水洗冷凝管下口外面，继续蒸馏1min。移开三角瓶，用表面皿覆盖瓶口。

③排废液及洗涤。蒸馏完毕后，继续加热蒸汽烧瓶，待反应室外壳烫手时，打开夹子i，夹紧夹子h，使反应室内容物倒吸入b瓶中并放出。排完反应室废液后，打开夹子h，夹紧夹子i，从漏斗d加入20mL蒸馏水，放入反应室，继续加热，重复排废液操作，将反应室内洗涤液排出，反复洗2～3次，直至用硼酸指示剂混合液检查合格为止，再做下次蒸馏。按以上操作，用标准（NH₄）₂SO₄溶液蒸馏3～5次，分别以0.0100mol/L HCl标准溶液滴定，计算直到实验数值与实际浓度误差不超过0.1%时，方可正式进行样品和空白的蒸馏。

（3）样品及空白蒸馏取5mL消化好的样品或空白稀释液进行蒸馏，其余与标准（NH₄）₂SO₄溶液练习操作相同。

3.滴定

用0.0100mol/L HCl标准溶液滴定三角瓶中的吸收液，直至硼酸指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。

4.计算

标准（NH₄）₂SO₄含量（mg氮/mL）=V×c×14

式中 V——滴定试样时消耗HCl标准溶液体积，mL；

V₀——滴定空白时消耗HCl标准溶液体积，mL；

c——HCl标准溶液的浓度，mol/L；

14——消耗1mL，1mol/L HCl标准溶液相当于氮的质量，mg；

m——称量样品的质量，g；

6.25——氮换算成蛋白质的系数；

1000——mg换算成g的系数。