生化实验：纸上层析法分离鉴定氨基酸

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：纸上层析法是生物化学中分离、鉴定氨基酸混合物的经典技术，可用于蛋白质、氨基酸组成定性鉴定和定量测定，也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一种分离分析工具。图3-5 卷成筒状的层析滤纸图3-6 层析图谱1—原点 2—斑点中心 3—溶剂前沿6.Rf值计算：用尺子分别测量原点至各显色斑点中心的距离以及原点至溶剂前沿的距离，计算其比值，即可得各标准氨基酸及混合液中各氨基酸的Rf值。

【目的要求】

1.学习纸上层析法的基本原理。

2.掌握氨基酸纸上层析的操作技术。

【实验原理】

纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。分配层析是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离的一种技术，即指溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时的浓度比，也为该溶质在两相中溶解度之比。

滤纸纤维的—OH为亲水性基团，与水有很强的亲和力，而与有机溶剂的亲和力极弱。所以纸层析是以有机溶剂饱和的水为固定相，而以水饱和的有机溶剂为流动相。

展层时，将样品点在距滤纸一端2～3cm的某一处，该点称为原点。然后在密闭的展层缸内，层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配。由于分配系数不同，其结果会分布在滤纸的不同位置。物质被分离后在纸层析图谱上的位置即在纸上的移动速度可用R_f值来表示。所谓R_f值是指在纸层析中从原点至层析点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值：

纸层析中，在一定条件下，某一物质的分配系数（R_f）是常数。R_f值的大小与物质的结构、溶剂系统、pH、层析温度和层析滤纸的质量等因素有关。

（1）物质结构根据相似相容原理，极性物质易溶于极性溶剂（水）中，而非极性物质易溶于非极性物质（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。

（2）溶剂系统同一物质在不同溶剂系统中R_f值不同。选择溶剂系统时应使被分离物质在适当的R_f值范围内（0.05～0.85之间），并且不同物质的R_f值至少差别0.05才能彼此分开。溶剂的极性大小也影响物质的R_f值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的R_f值随着溶剂碳原子数目增加而降低。

（3）pH溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式。酸性氨基酸在酸性溶液中所带静电荷比在碱性时少，带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂系统中R_f值较碱性溶剂系统中大，而碱性氨基酸则相反。

（4）层析滤纸的质量层析用滤纸要质地均匀、紧密，有一定的机械强度，并含杂质少。国产新华滤纸可用于一般的纸层析。如对层析要求高，应事先将滤纸用0.01mol/L HCl溶液处理以去除纸上的Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺等离子。

（5）温度和时间温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对R_f值影响很大，所以层析时最好控制温度不要相差±0.5℃。当所有条件相同时，氨基酸层析时间短，则R_f值小。

纸上层析法是生物化学中分离、鉴定氨基酸混合物的经典技术，可用于蛋白质、氨基酸组成定性鉴定和定量测定，也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一种分离分析工具。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）展层剂正丁醇、80%甲酸和水以体积比30∶6∶4在容量瓶中进行混合并充分振摇。

（2）氨基酸标准液（1000μg/mL）谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸（白氨酸），分别配制成该浓度溶液。

（3）氨基酸混合液（500μg/mL）谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸的混合液。

（4）0.1%茚三酮丙酮溶液。

2.器材(www.chuimin.cn)

新华1号滤纸；培养皿；烧杯；毛细管；吸量管；铅笔；尺子；层析缸；电吹风；订书机；玻璃板。

【操作方法】

1.配制展层剂：按正丁醇∶80%甲酸∶水为30∶6∶4的比例配制40mL展层剂倒入培养皿中，立即放入密闭的层析缸下。

2.滤纸准备：取1张新华1号滤纸（20cm×20cm），以顺滤纸纹方向为高，在距滤纸底边2cm处用铅笔画一直线，在此直线上等距离点8个点（每人4个），然后在每个点下面分别标出谷、亮、脯、混合字样，作为相应溶液的点样处（如图3-4所示）。

图3-4 层析滤纸图

3.点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在8个相应的点样处。将毛细管口轻触到纸面，样品自动流出。点样时，必须等第1滴样品用冷风吹干后再点第2滴，如此反复3～5次，点子扩散直径控制在0.1～0.2cm内。将点样后的滤纸两边对齐，用订书机将滤纸钉成筒状（图3-5）。纸的两边不能接触，避免由于毛细现象使溶剂沿边缘快速移动而造成溶剂前沿不齐影响R_f值。

4.展层：将钉好的筒状滤纸垂直浸入展层剂中，展层2～3h。当展层剂距纸的上沿2～3cm时取出滤纸，用吹风机的热风吹干。

5.显色：用吸量管吸取5mL0.1%茚三酮-丙酮溶液均匀撒在滤纸上，立即用吹风机热风吹干，即可显出各氨基酸层析斑点。用铅笔轻轻描出显色斑点的形状（图3-6）。

图3-5 卷成筒状的层析滤纸

图3-6 层析图谱

1—原点 2—斑点中心 3—溶剂前沿

6.R_f值计算：用尺子分别测量原点至各显色斑点中心的距离以及原点至溶剂前沿的距离，计算其比值，即可得各标准氨基酸及混合液中各氨基酸的R_f值。

【要点提示】

1.手上的汗渍会污染滤纸，层析前必须先洗干净手或带上一次性手套再拿滤纸。

2.点样时，尽量不要用手直接接触滤纸，以免污染。

3.点样毛细管不要混淆，防止相互污染。

【思考题】

1.谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸与茚三酮反应各显什么颜色？试从分子结构特点说明在本实验条件下R_f值不同的原因。