蛋白质性质实验-生物化学实验指导

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：可用于蛋白质的定性或定量测定。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。

一、蛋白质及氨基酸的呈色反应

【目的要求】

1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

（一）双缩脲反应

【实验原理】

尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu²⁺结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应（图3-2）。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

【试剂与器材】

1.试剂

尿素；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%卵清蛋白溶液。

图3-2 双缩脲反应小紫红色铜双缩脲复合物分子

2.器材

酒精灯；试管夹；试管1.5cm×15cm。

【操作方法】

1.取黄豆粒大小的尿素，放入干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加1mL10%氢氧化钠溶液，振荡混匀，再加1滴1%硫酸铜溶液，再振荡。观察出现的粉红颜色（避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色）。

2.另取一试管加1mL卵清蛋白溶液和2mL10%氢氧化钠溶液，摇匀，再加2滴1%硫酸铜溶液，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。

（二）茚三酮反应

【实验原理】

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行（图3-3），首先是氨基酸被氧化，产生CO₂、NH₃和醛，而水和茚三酮被还原为还原型茚三酮，然后是还原型茚三酮与另一分子水和茚三酮与NH₃缩合生成有色物质。

β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；

（2）0.5%甘氨酸溶液；

（3）0.1%茚三酮水溶液；

（4）0.1%茚三酮-乙醇溶液；

（5）蛋白质溶液。

2.器材

恒温水浴锅；试管及试管夹；烧杯；酒精灯；电磁炉；不锈钢锅；滤纸。

【操作方法】

1.取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1mL，再各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1～2min，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。

图3-3 蛋白质、氨基酸的茚三酮反应

2.在一小块滤纸上滴1滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴1滴0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

（三）黄色反应

【实验原理】

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。

多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

【试剂与器材】

1.试剂

10%氢氧化钠溶液；鸡蛋清溶液；浓硝酸；指甲或头发。

2.器材

恒温水浴锅；试管；试管夹；烧杯；酒精灯。

【操作方法】

1.取一支试管，加鸡蛋清溶液1滴及浓硝酸2滴，由于强酸作用，出现蛋白质沉淀。用微火加热，沉淀变为黄色。冷却后，逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

2.剪一些指甲或头发放入试管，加入数滴浓硝酸，观察颜色变化。

（四）乙醛酸反应

【实验原理】

含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸（CHOCOOH）缩合，形成与靛蓝相似的物质。此反应机理尚不清楚，可能是由一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合而成的。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。

【试剂与器材】

1.试剂

蛋白质溶液；冰醋酸；浓硫酸（分析纯）；2%白明胶。

2.器材

恒温水浴锅、试管及试管夹。(www.chuimin.cn)

【操作方法】

取2支试管，分别加入蛋白质溶液和5滴2%白明胶，再加浓冰醋酸1～2mL，混匀，倾斜试管慢慢地沿管壁各加1mL浓硫酸，使之两相重叠，静置5min后则两相界面处出现紫红色环，若效果不明显可水浴加热。

（五）醋酸铅反应和亚硝基铁氰化钠反应

【实验原理】

多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下可分解产生硫化钠。硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。

蛋白质中的半胱氨酸和胱氨酸极易脱硫，而含硫的氨基酸甲硫氨酸对强碱相当稳定，不产生此反应。在碱性条件下含有—SH的半胱氨酸与亚硝基铁氰化钠反应形成玫瑰色物质。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）未稀释的鸡蛋清。

（2）10%的NaOH溶液。

（3）1.5%Pb（Ac）₂溶液（醋酸铅溶液）。

（4）5%亚硝基铁氰化钠。

（5）浓盐酸。

（6）0.3%苯丙氨酸、0.3%酪氨酸、0.3%半胱氨酸。

2.器材

恒温水浴锅；试管及试管夹；酒精灯。

【操作方法】

1.向试管中先加入1.5%Pb（Ac）₂溶液约1mL，再慢慢滴加10%的NaOH溶液，边加边振摇，直到产生的沉淀溶解为止。此时再向试管内加未稀释的鸡蛋清5～6滴，混匀。置酒精灯上加热1min，溶液变黑，小心加入2mL浓盐酸，黑色褪去，嗅其味。

2.在白瓷板上，各加0.3%苯丙氨酸、0.3%酪氨酸、0.3%半胱氨酸溶液各2滴，分别加3滴10%NaOH溶液和2～3滴5%亚硝基铁氰化钠溶液，观察显色反应（颜色不稳定，会很快消失）。

二、蛋白质的沉淀反应

【目的要求】

1.熟悉蛋白质的沉淀反应。

2.进一步掌握蛋白质的有关性质。

【实验原理】

多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）蛋白质试液。

（2）1%醋酸铅 1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100mL。

（3）5%鞣酸溶液 5g鞣酸溶于水并稀释至100mL。

（4）1%硫酸铜溶液 1g硫酸铜溶于水并稀释至100mL。

（5）1%硝酸银。

（6）10%三氯乙酸。

（7）5%磺基水杨酸。

2.器材

（1）试管1.5cm×15cm（×7）。

（2）吸管5.0mL（×2）、2.0mL（×2）、1.0mL（×1）。

（一）乙醇沉淀蛋白质

乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体的水化层而使其沉淀析出。

【操作方法】

取蛋白质溶液1mL，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2mL混匀。观察有无沉淀析出。

（二）重金属盐析沉淀蛋白质

蛋白质与重金属离子（如Cu²⁺、Ag⁺、Hg²⁺等）结合成不溶性盐类而沉淀。

【操作方法】

取试管3支，分别加入蛋白质溶液1mL，再分别加入1%AgNO₃、1%醋酸铅、1%CuSO₄溶液各1～3滴，振荡试管，观察沉淀生成。放置片刻，倾去上清，加少量水，观察沉淀是否溶解，解释原因。

（三）有机酸沉淀蛋白质

【操作方法】

取试管2支，分别加入蛋白质溶液1mL，再分别加入10%三氯乙酸和5%磺基水杨酸溶液各1～3滴，振荡试管，观察沉淀生成。放置片刻，倾去上清，加少量水，观察沉淀是否溶解，解释原因。

【要点提示】

1.当加热试管时，试管口不准对着别人。

2.闻带有刺激性气味的气体时，用手扇着闻少许即可，不要直接凑到管口去闻。

【思考题】

1.蛋白质有哪些显色反应？

2.列表写出蛋白质的颜色反应和沉淀反应。

蛋白质性质实验-生物化学实验指导

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