血液中转氨酶活力测定：实验三十五

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：掌握谷丙转氨酶活力的测定方法。本实验以丙氨酸及α—酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。经转氨基作用后，α—酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长520m处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α—酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可测定谷丙转氨酶的活力。在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数，计算每100mL血清中转氨酶的活力单位数。

实验类型综合性

教学时数 3

一、实验目的

（1）了解转氨酶的性质及临床意义。

（2）掌握谷丙转氨酶活力的测定方法。

二、实验原理

生物体内广泛存在的氨基转移酶也称转氨酶，能催化α—氨基酸的α—氨基与α—酮酸的α—酮基互换，在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。此过程可用下式表示：

在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α—酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。此反应可逆，平衡点近于1。无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可测定生成的α—酮酸，因此可有多种测定方法。

本实验以丙氨酸及α—酮戊二酸作为谷丙转氨酶（GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2，4—二硝基苯肼结合，生成丙酮酸—2，4—二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439～530nm，可用于测定丙酮酸含量。

α—酮戊二酸也能与2，4—二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酸酮二硝基苯稍有差别，在520m波长比色时，α—酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转氨基作用后，α—酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长520m处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α—酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可测定谷丙转氨酶的活力。

三、实验仪器与试剂

1.材料(www.chuimin.cn)

人血清。

2.仪器

722型（或7220型）分光光度计、试管、移液器。

3.试剂

谷丙转氨酶基质液（pH7.4）、2，4—二硝基苯肼液、4mol/L NaOH溶液、2μmol/mL丙酮酸钠标准液、pH7.4磷酸盐缓冲液。

四、实验内容

（1）取试管6支，按下表进行操作。用丙酮酸物质的量（μmol）为横坐标，光吸收值A_505nm为纵坐标，画出标准曲线。

（2）另取2支试管，按下表进行操作。

在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数（用 1μmol丙酮酸代表 1.0单位酶活力），计算每100mL血清中转氨酶的活力单位数。

五、思考题