肌糖原酵解：生物化学实验成果

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型综合性教学时数 3一、实验目的学习鉴定糖酵解作用的原理和方法。以动物肌肉组织中肌糖原的酵解过程为例：肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。糖原或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观察。向3、4号空白管内加入3mL 20%三氯乙酸，用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。

实验类型综合性

教学时数 3

一、实验目的

（1）学习鉴定糖酵解作用的原理和方法。

（2）了解酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。

二、实验原理

在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。以动物肌肉组织中肌糖原的酵解过程为例：肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖原首先磷酸化，经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯、丙酮酸等一系列中间产物，最后生成乳酸。该过程可综合在下列反应式：

糖原酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时，必须在无氧条件下进行；而用肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循环和氧化呼吸链）的酶系统，则集中在线粒体中，糖原可用淀粉代替。

糖原或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观察。在除去蛋白质与糖后，乳酸可以与硫酸共热变成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质，根据颜色的显现加以鉴定。该法比较灵敏，每毫升溶液含1～5μg乳酸即产生明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定结果，因此实验中应尽量除尽这些物质。另外，测定时所用的仪器应严格地洗涤干净。

三、实验仪器与试剂

1.材料

家兔或大白鼠的肌肉糜。

2.仪器

电子天平、恒温水浴锅、试管及试管架、剪刀、镊子、移液管、滴管、玻璃棒、漏斗、滤纸、量筒。

3.试剂(www.chuimin.cn)

1/15mol/L pH7.4磷酸缓冲液，0.5%淀粉溶液，液体石蜡，CuSO₄饱和溶液，Ca（OH）₂粉末，20%三氯乙酸溶液，浓硫酸，对羟基联苯试剂。

四、实验内容

1.肌肉糜的制备

将家兔或大白鼠杀死后，立即剥皮，割取背部和腿部肌肉，在低温条件下用剪刀尽量把肌肉剪碎即成肌肉糜，低温保存备用（临用前制备）。

2.肌肉糜的糖酵解

取4支试管，编号后各加入新鲜肌肉糜0.5g。1、2号管为样品管，3、4号管为空白管。向3、4号空白管内加入3mL 20%三氯乙酸，用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。然后分别向4支试管内加入3mL磷酸缓冲液和1mL 0.5%淀粉溶液。用玻璃棒充分搅匀，再分别加入少许液体石蜡以隔绝空气（试管的3～5mm高度），并将4支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。

1h后，取出试管，吸出石蜡，立即向1、2号试管内各加入4mL 20%三氯乙酸，充分混匀。然后向每管内加入 1mL饱和CuSO₄溶液，混匀，再加入0.4g Ca（OH）₂粉末，充分搅匀2min，放置10min，使糖沉淀完全后，过滤，保留滤液。

3.乳酸的测定

取4支洁净、干燥试管，编号，各加入2mL浓硫酸，将试管置于冰浴中冷却。分别取每个样品的滤液2滴，逐滴加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中，边加边摇动冰浴中的试管，避免试管内的溶液局部过热，应注意冷却。

将每个试管混合均匀后，放入沸水浴中煮沸5min。冷却后，再加入对羟联苯试剂2滴，勿将对羟基联苯试剂滴到试管壁上，混匀，比较和记录各管溶液的颜色深浅，并加以解释。

续表

五、思考题

（1）本实验要在37℃保温前不加液体石蜡是否可以？为什么？

（2）在本实验中，怎样做才能尽可能减小误差得出理想的结果？