底物浓度对米氏常数的影响

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型综合性教学时数 6一、实验目的了解底物浓度对酶活力的影响。这个方程表明当已知Km及V时，酶促反应的速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。测定酶促反应的Km值是酶学研究的一个重要方法。本实验利用胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver-Burk双倒数作图法测定Km值。

实验类型综合性

教学时数 6

一、实验目的

（1）了解底物浓度对酶活力的影响。

（2）学习测定米氏常数的方法。

二、实验原理

酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：

式中 v——反应速度（微摩尔浓度变化/min）；

V——最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；

[S]——底物浓度，mol/L；

K_m——米氏常数，mol/L。

这个方程表明当已知K_m及V时，酶促反应的速度与底物浓度之间的定量关系。K_m值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶K_m值不同，同一种酶与不同底物反应K_m值可能不同，K_m值一定程度上反映酶与底物的亲和力大小：K_m值大，表明亲和力小；K_m值小，表明亲和力大。测定酶促反应的K_m值是酶学研究的一个重要方法。多数酶的K_m值在0.01～100mmol/L。

Linewaeaver-Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测K_m值的最常用的简便方法：

于是实验时可选择不同的[S]，测对应的v；以1/v对1/[S]作图，得到一个斜率为K_m/V的直线。该直线截距的负倒数为K_m值。

本实验利用胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver-Burk双倒数作图法测定K_m值。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L—精氨酸和L—赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可通过甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量，从而跟踪反应过程，求得初速度。

三、实验仪器及试剂

1.仪器(www.chuimin.cn)

恒温水浴锅。

2.试剂

（1）10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）分别取10、20、30、40g酪蛋白溶于约900mL水中，加20mL 1mol/L NaOH连续振荡，微热直至溶解，以1mol/L HCl或1mol/L NaOH调pH至8.5，定容至1L，即生成4种不同[S]的酪蛋白标准溶液。

（2）中性甲醛溶液 75mL甲醛（A·R）加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1mol/L NaOH滴至微红，密闭于保存。

（3）0.25%酚酞 2.5g酚酞溶于50%乙醇，定容至1000mL。

（4）标准0.1mol/L NaOH溶液。

四、实验内容

（1）取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与 1滴酚酞，以0.1mol/L标准NaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。

（2）量取40g/L酪蛋白50mL，加入三角瓶，37℃保温10min；同时胰蛋白酶液也在37℃保温10min，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中（同时计时）。充分混合后立即取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号），加10滴酚酞；以0.1mol/L NaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的NaOH体积（mL），每毫升加1滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的0.1mol/L NaOH的体积（mL）。

（3）在2min、4min、6min时，分别取出10mL反应液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上操作，记下耗去NaOH体积（mL）。

（4）以滴定度[即耗去的NaOH体积（mL）]对时间作图，得一直线，其斜率即初速度，为V₄₀（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。

（5）分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V₃₀、V₂₀、V₁₀。

（6）利用上述结果，以1/v对1/[S]作图，即求出V与K_m值。

五、思考题

（1）测定酶的米氏常数K_m值有何实际应用价值？

（2）本实验为定量实验，在操作过程中应注意哪些环节和减少误差？

底物浓度对米氏常数的影响

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