质粒DNA提取与琼脂糖凝胶电泳的实验成果

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型综合性教学时数 6操作视频一、实验目的掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。了解琼脂糖凝胶电泳的原理和应用范围，掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的方法。提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。琼脂糖凝胶电泳是在电场作用下，利用琼脂糖的分子筛效应，使DNA分子从负极向正极移动。

实验类型综合性

教学时数 6

操作视频

一、实验目的

（1）掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。

（2）了解琼脂糖凝胶电泳的原理和应用范围，掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的方法。

二、实验原理

1 .质粒DNA的提取

质粒（Plasmid）是存在于细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在 1～200kb以上不等。它是独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒在基因工程中是最常用的载体。提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。

提取质粒首先要进行大肠杆菌细胞的制备，制备后可以用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这是因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

2.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳技术（Agarosegelelectroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片段的有效方法。凝胶分辨率取决于使用凝胶的浓度，最大分辨率可以分离分子大小相差50个bp的DNA分子。琼脂糖凝胶可分辨0.1～6.0kb的双链DNA片段。在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷。琼脂糖凝胶电泳是在电场作用下，利用琼脂糖的分子筛效应，使DNA分子从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）等可以与双链DNA结合的作用的染料进行染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。

三、实验仪器与试剂

1.材料

大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，pMD18T质粒。

2.仪器

恒温振动培养箱、恒温水浴锅、低温高速离心机、微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外投射仪、紫外分光光度计、细菌培养瓶、1.5mL EP管。

3.试剂

无水乙醇、氨苄青霉素粉末、DNA marker、琼脂糖、溴化乙锭水溶液（10mg/mL）、1mmol/L EDTA、Tris-HCl（pH8.0）饱和苯酚。

（1）溶液Ⅰ 50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L EDTA。

（2）溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH，1%SDS，用前新配制。

（3）溶液Ⅲ 5mmol/L KAc溶液，pH4.8。

（4）TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.0。

（5）LB液体培养基胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加蒸馏水溶解，用NaOH调pH至7.5，加水至1000mL，高压灭菌。

（6）TAE电泳缓冲液 40mmol/L Tris，20mmol/L NaAc，1mmol/L EDTA pH8.0。(www.chuimin.cn)

（7）上样缓冲液 0.25%溴酚蓝、30%甘油。

（8）氯仿/异戊醇体积比为24∶1。

四、实验内容

1 .质粒DNA的提取（碱裂解法）

（1）将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2mL LB液体培养基的10mL试管里，37℃振荡培养过夜，16～18h。

（2）取培养的菌液1.5mL移至1.5mL Eppendorf管中，8000r/min离心30s，尽量除去上清液。

（3）加入100μL预冷的溶液Ⅰ，盖紧EP管盖，剧烈振荡，冰上放置5min。

（4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，温和翻转EP管5次（可观察到溶液逐步由混浊变为透明），轻轻混匀内容物，冰上放置5min。

（5）加入150μL预冷的溶液Ⅲ，将EP管盖紧后来回翻转2～3次，混匀后冰上放置5min，12000r/min离心15min。

（6）将上清液转移到另一个EP管中（吸取时不可吸入底部的沉淀）。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提1次，取上清液移入一个新的EP管。

（7）加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc（3mol/L，pH5.2），盖紧，并翻转EP管数次混匀。

（8）室温放置5min后，以12000r/min离心5min，弃尽上清液。

（9）加入1mL 70%乙醇洗涤管底白色沉淀，吸去上清液，空气干燥或真空抽干。

（10）将沉淀溶于20μL TE缓冲液或ddH₂O，完全溶解后，-20℃保存。

（11）提纯质粒的鉴定：紫外吸收检测质粒DNA的浓度和纯度。

2.琼脂糖凝胶电泳

（1）灌胶将黏胶纸粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。取一烧杯，加入琼脂糖1.2g和TBE缓冲液100mL，混匀，加热至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入5μL饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。

（2）上样电泳将胶块移入电泳槽，点样孔一侧靠近负极，注入TBE缓冲液，浸没凝胶，轻轻拔出梳子。加1μL上样缓冲液与5μL质粒溶液混匀，用移液器小心加样。加样时，加样枪头尖端插入上样孔内1/3高度，轻轻将样品推入，使相对密度较大的样品自然沉入上样孔底。避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部。开启电源，电压调至100V。通常30min后检查。

（3）染色电泳结束后，将凝胶放入溴化乙锭水溶液中，脱色摇床上染色20min。

（4）结果观察置凝胶于长波紫外透射仪上，可见清晰的呈淡橘红色的标准品若干梯度条带、质粒DNA泳道可见3个条带。

五、思考题

（1）简要描述质粒提取中，溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用以及加入三种溶液反应体系所出现现象的成因。

（2）回答质粒提取中酚氯仿的作用。

（3）质粒电泳后为什么出现三个条带？三个条带分别是什么？

质粒DNA提取与琼脂糖凝胶电泳的实验成果

相关推荐