酵母RNA分离与组分鉴定

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型验证性教学时数 3操作视频一、实验目的掌握酵母RNA提取的方法。RNA可溶于碱性溶液，用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，离心除去蛋白质和菌体后，上清液用乙醇沉淀，由此可得RNA的粗制品。RNA由核糖、碱基和磷酸组成，加入硫酸煮沸后可使其水解，从水解液中可对上述组分进行分别鉴定。向上述含有RNA的离心管内加10% H2SO45mL，加热煮沸1～2min，将RNA水解。

实验类型验证性

教学时数 3

操作视频

一、实验目的

（1）掌握酵母RNA提取的方法。

（2）了解核酸的组成。

（3）掌握鉴定核酸组分的方法和操作。

二、实验原理

酵母中RNA含量可达酵母干重的2%～10%，DNA则少于0.5%。RNA可溶于碱性溶液，用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，离心除去蛋白质和菌体后，上清液用乙醇沉淀，由此可得RNA的粗制品。RNA由核糖、碱基和磷酸组成，加入硫酸煮沸后可使其水解，从水解液中可对上述组分进行分别鉴定。

①磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化成无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷酸铵（黄色沉淀）。当有还原剂存在时，磷酸铵立即转变成蓝色的还原产物：钼蓝。

②核糖：RNA与浓盐酸供热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，在Fe³⁺或Cu²⁺催化下后者与苔黑酚反应，生成鲜绿色复合物。

③嘌呤碱：嘌呤碱与AgNO₃能产生白的嘌呤银化物沉淀。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

100mL三角瓶、沸水浴、量筒、滴管、试管及试管架、烧杯、离心机。(www.chuimin.cn)

2.试剂

0.2% NaOH氢氧化钠溶液，乙酸，95%乙醇，10%硫酸溶液，浓氨水，5%硝酸银溶液。

（1）苔黑酚（地衣酚）试剂将200mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mL FeCl₃·6H₂O临时用配制。

（2）定磷试剂 ①17%硫酸溶液：将19mL浓硫酸（相对密度1.84）缓缓加入到 83mL水中；②2.5%钼酸铵溶液：将 2.5g钼酸铵溶于 100mL水中；③10%抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合——①∶②∶③∶水=1∶1∶1∶2。

四、实验内容

（1）取2g干酵母置于100mL三角瓶中，加入0.2%NaOH溶液20mL，沸水浴30min，经常搅拌，加入乙酸数滴使提取液呈酸性（用pH试纸鉴定），4000r/min离心5～10min。

（2）取上清液加95%乙醇20mL，边加边搅拌，4000r/min，离心5～10min。

（3）沉淀用95%乙醇洗2次，每次10mL搅拌沉淀，离心，沉淀为粗RNA。

（4）向上述含有RNA的离心管内加10% H₂SO₄5mL，加热煮沸1～2min，将RNA水解。

①核糖：取水解液0.5mL，加苔黑酚试剂1mL，加热至沸1min，注意溶液是否变绿。

②嘌呤碱：取水解液2mL，加入氨水2滴及5%AgNO₃1mL，观察是否有絮状嘌呤银化物产生。

③磷酸：取水解液1mL，加入定磷试剂1mL，观察溶液是否呈蓝色。

五、思考题

用地衣酚鉴定RNA时加入Cu²⁺或Fe³⁺的目的是什么？