生物化学实验：二十二核酸的定量测定-定糖法

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型验证性教学时数 3一、实验目的学习和掌握测定RNA含量的定糖法的原理和操作技术。样品溶液RNA浓度在20～100μg/mL范围内。地衣酚试剂先配制0.1%三氯化铁浓盐酸溶液（A·R）。使用前再用上述溶液为溶剂配成0.1%的地衣酚溶液。根据测得的吸光度值，从标准曲线上查出相当该吸光度的RNA的浓度，按下式计算样品中RNA的含量。

实验类型验证性

教学时数 3

一、实验目的

学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技术。

二、实验原理

核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3，5—二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20～200μg/mL范围内，吸光度与RNA的浓度呈正比关系。由于地衣酚反应特异性较差，凡戊糖组分均可与地衣酚反应，在反应液中如混有DNA或其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定RNA时，应先除去DNA等杂质，排除DNA等杂质影响，也可先测定DNA的含量，再计算出RNA的含量。

地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来源的纯化RNA作RNA—核糖标准曲线，然后从曲线求得被测样品的RNA含量。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

试管及管架、水浴锅、移液管（1，2，5mL）、可见分光光度计。

2.试剂

（1）RNA标准溶液取酵母RNA配成200μg/mL的标准溶液（如不溶，可滴加氢氧化铵溶液，调至pH=7.0）。

（2）样品溶液RNA浓度在20～100μg/mL范围内（自己提取）。(www.chuimin.cn)

（3）地衣酚试剂先配制0.1%三氯化铁浓盐酸溶液（A·R）。使用前再用上述溶液为溶剂配成0.1%的地衣酚溶液（临用时配制）。

四、实验内容

1 . RNA标准曲线的制作

取6支试管，编号，按下表加入试剂。

加毕，摇匀，置沸水浴中加热15min，冷却，测A_670nm值。以A_670nm值为纵坐标，RNA浓度（μg/mL）为横坐标作图绘制标准曲线。