核酸定量测定结果：定磷法生物化学实验

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型验证性教学时数 3一、实验目的掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法。钼蓝在660nm处有最大光吸收峰，在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量呈正比，可用比色法测定。

实验类型验证性

教学时数 3

一、实验目的

掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法。

二、实验原理

核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为9.5%左右（RNA中含磷量为9.0%，DNA中含磷量为9.2%），因此通过测得核酸中有机磷的含量即可推算出核酸的量，即每测得1mg有机磷，就表示有11mg的核酸。用强酸使核酸分子中的有机磷消化成为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀）。

当有还原剂存在时，Mo^{6 +}被还原成Mo⁴⁺，此4价钼再与试剂中的其他结合成Mo（MoO₄）₂或Mo₃O₈，呈蓝色，称为钼蓝。钼蓝在660nm处有最大光吸收峰，在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量呈正比，可用比色法测定。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为 1～10μg无机磷。

生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

分析天平、容量瓶（50及 100mL）、台式离心机及离心管、凯氏烧瓶（50mL）、恒温水浴锅、200℃烘箱、硬质玻璃试管、移液管、分光光度计。

2.试剂

以下试剂均用分析纯，溶液要用重蒸水配制。

（1）标准磷溶液：将分析纯磷酸二氢钾（KH₂PO₄）预先置于105℃烘箱烘至恒重。然后放在干燥器内使温度降到室温，精确称取0.2195g（含磷50mg），用水溶解，定容至50mL（含磷量为1mg/mL），作为贮存液置冰箱中待用。测定时，取此溶液稀释100倍，使含磷量为10μg/mL。

（2）定磷试剂：3mol/L硫酸∶水∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸=1∶2∶1∶1（体积比）。配制时按上述顺序加试剂。溶液配制后当天使用。正常颜色呈浅黄绿色，如呈棕黄色或深绿色不能使用，抗坏血酸溶液在冰箱放置可用1个月。

（3）沉淀剂：称取1g钼酸铵溶于14mL 70%过氯酸中，加386mL水。

（4）5mol/L硫酸。

（5）5%氨水。

四、实验内容(www.chuimin.cn)

1.磷标准曲线的绘制

取试管6支，0～5依次编号。按下表加入各试剂。注意每加好一种试剂后应立即摇匀。

各反应液加毕后，于45℃水浴保温10min，冷却，置分光光度计中分别测定在其波长660nm的光吸收值（A_660nm）。以所得光吸收值为纵坐标，以无机磷含量为横坐标，作图，即得无机磷的标准曲线图。

2.总磷的测定

准确称取样品（粗核酸）0.1g，用少量蒸馏水溶解（如不溶，可滴加5%氨水至pH7.0），转移至50mL容量瓶中，加水至刻度（此溶液含样品2mg/mL）。吸取上述样液1.0mL，置于50mL克氏烧瓶中，加入2.5mL 10mol/L硫酸，将凯氏烧瓶接在凯氏消化架上（或在通风橱内），在电炉上加热，至溶液透明，表示消化完成。冷却，将消化液移入100mL容量瓶中，用少量水洗涤凯氏烧瓶两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加水至刻度，混匀后吸取3.0mL置于试管中，加定磷试剂3.0mL，45℃水浴中保温10min，冷却测A_660nm。

3.无机磷的测定

吸取样液（2mg/mL）1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0mL置试管中，加定磷试剂3.0mL，45℃水浴中保温10min，测A_660nm。

五、实验结果与计算

总磷A_660nm—无机磷A_660nm=有机磷A_660nm

由标准曲线查得有机磷的质量（μg），再根据测定时的取样体积（mL），求得有机磷的质量浓度（μg/mL）。按下式计算样品中核酸的质量分数：

式中 w——核酸的质量分数，%；

C——有机磷的质量浓度，μg/mL；

V——样品总体积，mL；

11——因核酸中含磷量为9%左右，1μg磷相当于11μg核酸；

M——样品质量，μg。

六、思考题

（1）为什么首先要用强酸对核酸样品进行消化？