实验二十核酸含量测定：紫外吸收法

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型验证性教学时数 3一、实验目的学习紫外吸收法测定核酸含量的原理。因而可以核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应；反之，变性DNA复性后，吸光度降低，称为减色效应。若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。

实验类型验证性

教学时数 3

一、实验目的

（1）学习紫外吸收法测定核酸含量的原理。

（2）掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法。

二、实验原理

核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（—C—C═C—C═C—），在紫外光区的250～290nm处有强烈的光吸收作用，最大吸收峰在260nm波长处。因而可以核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。利用紫外吸收法定量测定核酸时，通常规定：在260nm波长下，每毫升含1μgDNA溶液的A₂₆₀为0.020，而每毫升含1μgRNA溶液的A₂₆₀为0.022。故测定被测样品的A₂₆₀，即可计算出其中核酸的含量。不同形式DNA紫外吸光度不同，在核苷酸量相同的情况下：单核苷酸＞单链DNA＞双链DNA。当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应；反之，变性DNA复性后，吸光度降低，称为减色效应。

蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的最高吸收峰在 280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。从A₂₆₀/A₂₈₀的比值可判断样品的纯度。纯RNA的A₂₆₀/A₂₈₀≥2.0；DNA的A₂₆₀/A₂₈₀≥1.8。当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。RNA和DNA的比值分别低于2.0和1 . 8时，表示此样品不纯。pH对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH。

三、实验仪器与试剂

1.材料

RNA或DNA样品。

2.仪器

紫外—可见分光光度计、容量瓶（50mL）、离心机及离心管、冰箱。(www.chuimin.cn)

3.试剂

钼酸铵—过氯酸沉淀剂（0.25%钼酸铵—2.5%过氯酸溶液）：将3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中。

四、实验内容

取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入2.0mL DNA或者RNA样品液，然后向甲管加入2.0mL蒸馏水，向乙管加入2.0mL过氯酸—钼酸铵沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照），摇匀后置冰箱内30min，使沉淀完全，3000r/min离心10min。从甲、乙两管中各吸取上清液0.5mL转入相同编号的两容量瓶内，加蒸馏水定容至50mL，充分混匀。

取光程为1cm的石英比色杯，以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两管的A₂₆₀值及甲管的A₂₈₀值。

五、实验结果与计算

样品液中DNA/RNA总含量按下式计算：

式中 n——样品的稀释倍数。

样品的纯度可根据A₂₆₀/A₂₈₀比值进行判断。

六、思考题

（1）采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量有何优缺点？

（2）若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？