聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白相对分子质量

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型综合性教学时数 6操作视频一、实验目的理解SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的原理。若将已知相对分子质量的标准蛋白质的迁移率对相对分子质量的对数作图，可获得一条标准曲线。因此，对于这一类蛋白质，SDS—凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的相对分子质量，而不是完整分子的相对分子质量。

实验类型综合性

教学时数 6

操作视频

一、实验目的

（1）理解SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的原理。

（2）掌握垂直板电泳的操作技术。

二、实验原理

蛋白质混合样品中，各蛋白质组分的迁移率主要取决于其分子大小和形状以及所带电荷多少。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质—SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使各种蛋白质都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

当蛋白质的相对分子质量在15000～200000时，电泳迁移率与相对分子质量的对数值呈直线关系，符合下列方程：lgM_r=-bm_R+K（式中：M_r为蛋白质相对分子质量，m_R为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b和K均为常数）。若将已知相对分子质量的标准蛋白质的迁移率对相对分子质量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得相对分子质量。

三、实验仪器与试剂

1.材料

低相对分子质量标准蛋白质按照每种蛋白0.5～1mg/mL样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。

2.仪器

垂直板型电泳槽、直流稳压电泳仪、移液器、微量注射器、培养皿、滴管等。

3.试剂

（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液pH8.9）取 1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g，用无离子水溶解后定容至100mL。

（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液pH6.7）取 1mol/L盐酸48mL，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100mL。

（3）凝胶贮备液称丙烯酰胺（Acr）30g及N，N′—甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。

（4）10%SDS溶液SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

（5）1%TEMED。

（6）10%过硫酸铵（AP）现用现配。

（7）电泳缓冲液（Tris—甘氨酸缓冲液pH8.3）称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS 1.0g，用无离子水溶解后定容至1L。

（8）样品溶解液取SDS100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油 1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至 10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。

（9）染色液 0.25g考马斯亮蓝G250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。

（10）脱色液 75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。

四、实验内容

1.装板

将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液（夹子离梳子底边约2mm）。(www.chuimin.cn)

2.配制分离胶

根据所测蛋白质相对分子质量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGE不连续系统，在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶（12%）。

3.分离胶的灌注和聚合

用移液管将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶，然后加满蒸馏水。待分离胶凝固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。

4.浓缩胶的配制（5%）

在烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶

5.浓缩胶的灌注和聚合

用移液管将所配制的浓缩胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，将梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。

6.样品的准备

在低相对分子质量标准蛋白质和待测样品中分别加入适量还原缓冲液，放入沸水浴中加热3～5min，取出冷至室温。

7.加样

加入电极缓冲液，小心拔出梳齿，用微量注射器向凝胶梳孔内加样。同时加入Marker。

8.电泳

上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始时，电压控制在不高于100V，样品进入分离胶后，电压控制在不高于140V。待指示剂染料靠迁移至下沿1～1.5cm处停止电泳。

9.染色和脱色

小心将胶取出，放入一大培养皿中。

（1）染色加入染色液，置于摇床上染色2h。

（2）脱色染色完毕，倒出染色液，加入脱色液，置于摇床上脱色，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰，拍照。

五、实验结果与计算

量出分离胶顶端距溴酚蓝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与分离胶顶端的距离（cm），按下式计算相对迁移率m_R：

以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上计算出其相对分子质量。

六、注意事项

（1）不是所有的蛋白质都能用SDS—凝胶电泳法测定其相对分子质量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的相对分子质量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的相对分子质量是21000，但SDS—凝胶电泳测定的结果却是35000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的相对分子质量，互相验证。

（2）有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α—胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS—凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的相对分子质量，而不是完整分子的相对分子质量。为了得到更全面的资料，还必须用其他方法测定其相对分子质量及分子中肽链的数目等，与SDS—凝胶电泳的结果互相参照。

七、思考题

（1）用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇？

（2）用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，为什么有时和凝胶层析法所得结果有所不同？是否所有的蛋白质都能用SDS—凝胶电泳法测定其相对分子质量？为什么？

聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白相对分子质量

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