IgG葡聚糖凝胶过滤脱盐实验的生物化学成果

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。蛋白质溶液如含有无机盐离子，可利用葡聚糖凝胶层析的方法使蛋白质与无机盐分离，效果理想。沉淀即为IgG粗品。收集滤液，用作层析脱盐样品。

实验类型综合性

教学时数 9

操作视频

一、实验目的

（1）学习凝胶层析的工作原理和操作方法。

（2）掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。

二、实验原理

葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，是葡萄糖通过α-1，6—糖苷键形成的葡聚糖长链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交联而成的具有三维空间的多孔网状结构物，呈珠状颗粒。

蛋白质溶液如含有无机盐离子，可利用葡聚糖凝胶层析的方法使蛋白质与无机盐分离，效果理想。本实验中利用G-25使蛋白质（IgG）与（NH₄）₂SO₄分离。当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶柱时，小分子的（NH₄）₂SO₄扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，被排阻在凝胶颗粒（固定相）的外面。加入洗脱液（流动相）进行洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的（NH₄）₂SO₄扩散进凝胶颗粒的网孔之中，在层析柱中移动较慢，最后才能从柱中洗脱下来，这样蛋白质与（NH₄）₂SO₄就很容易地被分离开，从而达到对蛋白质样品脱盐的目的。

三、实验仪器与试剂

1.材料

IgG-（NH₄）₂SO₄溶液。

2.仪器

铁架台、层析柱（11mm ×300mm）、滴定管夹、刻度滴管、刻度试管、白瓷反应板、Sephadex G-25、乳胶管、恒流泵（或螺旋夹）、弹簧夹、烧杯。

3.试剂

（1）奈氏（Nessler）试剂将HgI₂11.5g及KI 8g溶于去离子水中，稀释至50mL，加入6mol/L NaOH 50mL，静置后取上清液储存于棕色瓶中。

（2）其他试剂 0.01mol/L pH7.0磷酸缓冲液、0.0175mol/L pH6.7磷酸盐缓冲液、饱和（NH₄）₂SO₄溶液、去离子水（洗脱液）。

四、实验内容(www.chuimin.cn)

1 . IgG的分离制备

取4mL血浆，加入4mL 0.01mol/L pH7.0磷酸缓冲液后，充分混匀，逐滴加入饱和（NH₄）₂SO₄溶液2mL，边加边搅拌，使（NH₄）₂SO₄饱和度达到20%。4℃放置15min。3000r/min，离心10min。

将上清液6mL转移至另一离心管，逐滴加入饱和（NH₄）₂SO₄溶液2mL，边加边搅拌，使（NH₄）₂SO₄饱和度达到 40%。4℃放置 15min。3000r/min，离心10min。

弃去上清液，向沉淀中加入4mL 0.01mol/L pH7.0磷酸缓冲液后，充分振荡，混匀。逐滴加入饱和（NH₄）₂SO₄溶液2.2mL，边加边搅拌，使（NH₄）₂SO₄饱和度达到35%。4℃放置15min。3000r/min，离心10min。沉淀即为IgG粗品。

弃去上清，向沉淀中加入0.0175mol/L pH6.7磷酸盐缓冲液 1mL，充分振荡，溶解沉淀。

过滤（可两小组合并过滤）。收集滤液，用作层析脱盐样品。

2.层析脱盐

（1）溶胀凝胶用去离子水沸水浴溶胀Sephadex G-25凝胶2h左右或用去离子水浸泡凝胶24h以上（中间需换一次水）。

（2）装柱将层析柱固定在铁架台上，两端分别连接乳胶管。上端与洗脱液连通，装一螺旋夹用于调控洗脱速度。如条件允许，可选用恒流泵控制洗脱速度。先用少量洗脱液洗柱并排除乳胶管中的气泡，待柱中洗脱液高度约2cm时，关闭下端开关式弹簧夹。

将溶胀好的Sephadex G-25倒入层析柱中，使其自然沉降，沉降后凝胶柱的高度为层析柱高度的3/4～4/5且柱床面平整比较理想。打开下端开口，排除多余的洗脱液，床面上保持约2cm高的洗脱液，关闭下口。

（3）洗柱（平衡）通过细乳胶管将洗脱液与层析柱接通，然后打开下端开口，让洗脱液滴下冲洗层析柱，以除去杂质并使柱床均匀密实。适当时间后（流下的洗脱液体积一般为柱床体积的2～3倍），关闭下口。洗柱过程中一般调整流速约2mL/min。

（4）加样洗脱用刻度滴管吸取1mL样品，滴管尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间有一清晰界面。打开下端开口，待样品全部进入凝胶柱时，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。

（5）收集检测用刻度试管收集洗脱液，每管收集1mL。边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。

铵盐检查：从每管中取收集液2滴置白瓷反应板穴中，加入奈氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀，以“+”的多少表示每穴中出现沉淀的多少。

蛋白质（IgG）检查：向每管剩余的收集液中加入磺柳酸溶液5滴，振荡，如有蛋白质洗脱下来，则出现浑浊或沉淀，以“+”的多少表示不同收集管中沉淀的程度。

五、思考题

分析蛋白质和铵盐洗脱的次序，并做出合理解释。

IgG葡聚糖凝胶过滤脱盐实验的生物化学成果

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