标准曲线法测定蛋白质含量掌握分光光度计的使用方法。掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。蛋白质含有两个以上肽键，因此有双缩脲反应。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用比色法测定，制作标准曲线并测定蛋白质含量。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。......
2023-11-09
蛋白质定量测定实验方法-Folin酚法
【摘要】：实验类型 综合性教学时数 6一、实验目的学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理。该法是蛋白质含量测定的最灵敏方法之一。在一定的浓度范围内，蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法可检测的最低蛋白质量达5μg。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。
实验类型 综合性
教学时数 6
一、实验目的
（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理。
（2）掌握Folin—酚法测定蛋白质含量的方法。
二、实验原理
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤，因此又称为Lowry法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。该法是蛋白质含量测定的最灵敏方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮蓝法所取代。
此法的显色原理与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了蛋白质检测的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原理为：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu2+结合，生成紫红色络合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的浓度范围内，蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比。
此法可检测的最低蛋白质量达5μg。通常测定范围是20～250μg。
三、实验仪器与试剂
1.材料
人血清或蛋清（稀释至浓度为200μg/mL）。
2.仪器
可见光分光光度计、恒温水浴锅、旋涡混合器、计时器、试管、试管架、移液管。
3.试剂
（1）试剂甲（A，B）：每次使用前，取50份A液与1份B液混合，新鲜配制。
A液：10g Na2CO3、2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），溶解于500mL蒸馏水中。
B液：0.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100mL蒸馏水中。
（2）试剂乙：在2L磨口回流瓶中，加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700mL蒸馏水，再加50mL 85%磷酸溶液，100mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10h，回流结束时，加入150g硫酸锂（Li2SO4）、50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色。稀释至 1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶，冰箱长期保存。
（3）标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或G—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250μg/mL。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用9g/L NaCl溶液配制。(www.chuimin.cn)
（4）9g/L生理盐水。
四、实验内容
1.标准曲线制作
取6支干净的刻度试管，编号，按照下表加入试剂。
向各管内分别加入新鲜配制的试剂甲2mL，混匀，室温放置10min。再加入试剂乙0.20mL，2s内迅速混匀。40℃水浴10min后，冷却至室温。以1号试管作空白对照，测定各管的吸光度值A500nm，以蛋白质含量为横坐标，A500nm值为纵坐标，绘制标准曲线；或以A500nm值为纵坐标（y），蛋白质含量为横坐标（x），利用Excel统计功能，导出回归方程y=ax+b。
注：①当试剂乙加到碱性的铜—蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前。
②在测定吸光度时，每管重复测三次，求平均值用于绘标准曲线。
2.样品测定
取4支干净的刻度试管，编号，按照下表加入试剂。
向各管内分别加入新鲜配制的试剂甲2mL，混匀，室温放置10min。再加入试剂乙0.20mL，2s内迅速混匀。40℃水浴10min后，冷却至室温。以1号试管作空白对照，测定各管的吸光度值A500nm。在标准曲线上分别查出其相当于标准蛋白的量，计算3个平行样品中蛋白质浓度的平均值；或利用曲线回归方程，根据A500nm测定值（y），换算出蛋白质浓度（x）并取其平均值。
若所测数据不在标准曲线范围内，应酌情调整待测液浓度。
五、思考题
（1）Folin—酚法进行蛋白质定量的优缺点。
（2）记录实验结果，完成实验报告。
六、注意事项
（1）干扰物质 此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如—CO—NH2，—CH2—NH2，—CS—NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tri s缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%）、胍（约0.5%）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1～2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。
（2）控制时间 因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1min后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2min后加第3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10min，则第1支试管可立即加入0.20mL Folin—酚试剂，1min后第2支试管加入0.20mL Folin—酚试剂，2min后加第3支试管，以此类推。40℃水浴10min，冷却后，每1min测定一管吸光值。
（3）标准曲线 在绘制标准曲线时，应根据所描点的分布情况，作过原点的直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。
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