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2023-11-04
生物化学实验：快速测定氨基酸浓度的实验方法
【摘要】：实验类型 验证性教学时数 6一、实验目的学习茚三酮溶液测定氨基酸浓度的操作，了解氨基酸定量的一些原理。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量呈正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。
实验类型 验证性
教学时数 6
一、实验目的
学习茚三酮溶液测定氨基酸浓度的操作，了解氨基酸定量的一些原理。
二、实验原理
茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量呈正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。
三、实验仪器与试剂
1.仪器
分光光度计、水浴锅。
2.试剂
（1）2mol/L醋酸缓冲液（pH5.4）量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。
（2）茚三酮显色液 称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。(www.chuimin.cn)
还原型茚三酮按下法制备：称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将5g维生素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
（3）样品液 每毫升含0.5～50μg氨基酸。
（4）其他试剂 0.3mmol/L标准氨基酸溶液，60%乙醇。
四、实验内容
1.标准曲线的制作
分别取标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1.0mL。各加入1.0mL醋酸缓冲液；再加入1.0mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3.0mL 60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
2.氨基酸样品的测定
取样品液1.0mL，加入1.0mL醋酸缓冲液和1.0mL茚三酮显色液，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60%乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。
五、实验结果与计算
氨基酸含量（mmol/L）=OD570nm
式中 OD570nm——对应标准曲线查得值。
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