八蛋白质与氨基酸的呈色反应生物化学实验

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型验证性教学时数 3操作视频一、实验目的学习鉴定蛋白质与氨基酸的方法及原理。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。此法可用于蛋白质的定性或定量测定。多数蛋白质分子都含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应。

实验类型验证性

教学时数 3

操作视频

一、实验目的

学习鉴定蛋白质与氨基酸的方法及原理。

二、实验原理

1.双缩脲反应

尿素加热到180℃左右，生成双缩脲并放出1分子NH₃，双缩脲在碱性环境中能与Cu²⁺结合生成紫红色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是多肽或蛋白质。此法可用于蛋白质的定性或定量测定。

2.茚三酮反应

除脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成紫色物质，该反应十分灵敏，目前广泛应用于氨基酸的定量测定。

3.黄色反应

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp），遇浓硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步生成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子都含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸才有黄色反应。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

试管、试管夹、烧杯、酒精灯、石棉网、三脚架。(www.chuimin.cn)

2.试剂

尿素，10% NaOH、1% CuSO₄、2%卵清蛋白溶液、0.5%甘氨酸（Gly）、0.3% Trp、0.3% Tyr、0.1%茚三酮水溶液、0.1%茚三酮—乙醇溶液、0.5%苯酚溶液、浓硝酸。

四、实验内容

1.双缩脲反应

（1）取少量尿素放在干燥的试管中，用微火加热使尿素熔化，当熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素释放出氨气，形成双缩脲。冷却后，加10%的NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加1%的CuSO₄溶液1滴再振荡，观察出现粉红色。[注：避免加入过量的CuSO₄，否则生成蓝色Cu（OH）₂能掩盖粉红色。]

（2）再取另一试管加卵清蛋白溶液约1mL和10%的NaOH溶液约2mL，摇匀，再加1%的CuSO₄溶液1～2滴再振荡，观察颜色变化，出现紫红色表示有蛋白质的存在。

2.茚三酮反应

（1）取两支试管分别加入蛋白质溶液和Gly溶液各 1mL，再各加0.5mL 0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1～2min，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝色。

（2）在一小块滤纸上滴 1滴0.5%的Gly溶液，风干后，再在原处滴 1滴0.1%茚三酮—乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

3.黄色反应

向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或微火加热，待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%NaOH溶液至碱性，观察颜色变化。

五、思考题

茚三酮反应中，蛋白质与氨基酸反应现象有何不同？分析其可能的原因。

八蛋白质与氨基酸的呈色反应生物化学实验

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