荧光光谱分析：定性和定量方法

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：物质所吸收光的波长和发射的荧光波长与物质分子结构有密切关系。利用这些性质对物质进行定性和定量分析的方法，称为荧光光谱分析法，也称为荧光分光光度法。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。

（一）分光光度计法

分光光度计法（spectrophotometry）是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一种方法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射一定浓度的样品溶液，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度A或光密度D）或透射程度（透光度T），以波长λ为横坐标，A或T为纵坐标，画出连续的“A-λ”或“T-λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线，见图1-1。

图1-1 吸收光谱曲线示意图

由图1-1可以看出吸收光谱的特征：

（1）曲线上A处称为最大吸收峰，它所对应的波长称为最大吸收波长，用λ_max表示。

（2）曲线上B处有一谷，称为最小吸收，所对应的波长称为最小吸收波长，用λ_min表示。

（3）曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰C，称为肩峰。

（4）在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上D处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。

λ _max是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，λ_max、λ_min、肩峰以及整个吸收光谱的形状取决于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。

在分光比色分析中，有色物质溶液颜色的深度取决于入射光的强度、有色物质溶液的浓度和溶液的厚度。当一束单色光透过有色物质溶液时，溶液的浓度越大，透过液层的厚度越大，则光线的吸收越多。朗伯—比尔（Lambert-Beer）定律是利用分光光度计进行比色分析的基本原理。一束单色光照射于一吸收介质表面，在通过一定厚度的介质后，由于介质吸收了一部分光能，透射光的强度就要减弱。吸收介质的浓度越大，介质的厚度越大，则光强度的减弱越显著，其关系式为：

式中 A——吸光度；

I₀——入射光的强度；

I_t——透射光的强度；

T——透射比，或称透光度；

K——系数，可以是吸收系数或摩尔吸收系数；

l——吸收介质的厚度，cm；

c——吸光物质的浓度，g/L或mol/L。

朗伯—比尔定律的物理意义是，当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度l成正比。

当介质中含有多种吸光组分时，只要各组分间不存在相互作用，则在某一波长下介质的总吸光度是各组分在该波长下吸光度的加和，这一规律称为吸光度的加和性。

系数K：当介质厚度l以cm为单位，吸光物质浓度c以g/L为单位时，K用a表示，称为吸收系数，其单位为L/（g·cm）。这时朗伯—比尔定律表示为A=alc。当介质厚度l以cm为单位，吸光物质浓度c以mol/L为单位时，K用k表示，称为摩尔吸收系数，其单位为L/（mol·cm）。这时朗伯—比尔定律表示为A=klc。两种吸收系数之间的关系为：k=aM_m。

若遵循朗伯—比尔定律，且l为一常数，光吸收对浓度绘图，得一通过原点的直线。根据朗伯—比尔定律，做出标准物质吸收对浓度的标准曲线，借助于这样的标准曲线，很容易根据测定其光吸收得知一未知溶液的浓度。

分光光谱技术可用于：

（1）通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成。

（2）通过测定不同波长下的吸收来测定物质的相对纯度（在DNA的浓度测定中最为常用，测定A_260nm/A_280nm，纯净DNA样品的此值为1.8。样品中若混有蛋白，A_260nm/A_280nm将变小。）

（3）通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或与其他物质混合存在的一种物质的含量。(www.chuimin.cn)

（4）通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系，追踪反应过程。

（5）通过测定微生物培养体系中D值，可以得到体系中微生物的密度，从而可以对培养体系中微生物的数量进行动态的监测。

（二）荧光分光分析法

当紫外光照射某一物质时，该物质会在极短的时间内，发射出比照射波长要长的光。而当紫外光停止照射时，这种光也随之很快消失，这种光称为荧光。荧光是一种光致发光现象。物质所吸收光的波长和发射的荧光波长与物质分子结构有密切关系。同一种分子结构的物质，用同一波长的激发光照射，可发射相同波长的荧光，但其所发射的荧光强度随着该物质浓度的增大而增强。利用这些性质对物质进行定性和定量分析的方法，称为荧光光谱分析法，也称为荧光分光光度法。与分光光度法相比较，这种方法具有较高的选择性及灵敏度，试样量少，操作简单，且能提供比较多的物理参数，现已成为生化分析和研究的常用手段。

1.荧光分析测定方法

荧光分析有定性和定量两种，一般定性分析采用直接比较法，就是将被测样品和已知标准样品在同样条件下，根据它们所发出的荧光的性质、颜色、强度等来鉴定它们属于同一种荧光物质。荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。

荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。

（1）直接测定法该法是利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定最简单的方法。某些物质只要本身能发荧光，将这类物质的样品做适当的前处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度。具体方法有两种：

①直接比较法：配制标准溶液的荧光强度F₁，已知标准溶液的浓度c₁，便可求得样品中待测荧光物质的含量；

②标准曲线法：将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线，再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。

为了使各次所绘制的标准曲线能重合一致，每次应以同一标准溶液对仪器进行校正。如果该溶液在紫外光照射下不够稳定，则必须改用另一种稳定而荧光峰相近的标准溶液来进行校正。例如，测定维生素B₁时，可用硫酸喹啉溶液作为基准来校正仪器；测定维生素B₂时，可用荧光素钠溶液作为基准来校正仪器。

（2）间接测定法有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低仅能显现非常微弱助荧光，无法直接测定。这时可采用间接测定方法。间接测定方法有以下几种：

①化学转化法：通过化学反应将非荧光物质转变为适合于测定的荧光物质。例如金属离子与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物。有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。

②荧光淬灭法：这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质所具有使某种荧光化合物的荧光淬灭的能力，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓度。

③敏化发光法：对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法，其荧光信号太微弱而无法检测。在此种情况下，可使用一种物质（敏化剂）以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。

以上三种方法均为相对测定方法，在实验时须采用某种标准进行比较。

2.影响荧光强度的因素

（1）溶剂溶剂能影响荧光效率，改变荧光强度。因此，在测定时必须用同一溶剂。

（2）浓度在较浓的溶液中，荧光强度并不随溶液浓度呈正比增长。因此，必须找出与荧光强度呈线性的浓度范围。

（3）pH荧光物质在溶液中绝大多数以离子状态存在，而发射荧光最有利的条件就是它们的离子状态。因为在这种情况下，由于离子间的斥力，最大限度地避免了分子之间的相互作用，每一种荧光物质都有它的最适发射荧光的离子状态，也就是最适pH。因此，须通过条件试验，确定最适宜的pH范围。

（4）温度荧光强度一般随温度降低而提高，这主要是由于分子内部能量转化的缘故。因为温度升高分子的振动加强，通过分子间的碰撞将吸收的能量转移给了其他分子，干扰了激发态的维持，从而使荧光强度下降，甚至熄灭。因此，有些荧光仪的液槽配有低温装置，使荧光强度增大，以提高测定的灵敏度。在高级的荧光仪中，液槽四周有冷凝水并附有恒温装置，以便使溶液的温度在测定过程中尽可能保持恒定。

（5）时间有些荧光化合物需要一定时间才能形成，有些荧光物质在激发光较长时间照射下会发生光分解。因此，过早或过晚测定荧光强度均会带来误差。必须通过条件试验确定最适宜的测定时间，使荧光强度达到最大且稳定。为避免光分解所引起的误差，应在荧光测定的短时间内才打开光闸，其余时间均应关闭。

（6）共存干扰物质有些干扰物质能与荧光分子作用使荧光强度显著下降，这种现象称为荧光的淬灭；有些共存物质能产生荧光或产生散射光，也会影响荧光的正确测量。故应设法除去干扰物，并使用纯度较高的溶剂和试剂。

荧光光谱分析：定性和定量方法

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