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叶片超显微结构观测方法及修改

【摘要】:7.1.2.4叶片超显微结构的观测参照万里强等、刘艳等和康萨如拉等的方法,略有修改。

7.1.2.1 植物叶片气体交换参数的测定

采用美国LI-COR 公司LI-6400-40 便携式光合测定系统,于干旱胁迫60 d 左右,选择晴朗无风的日子,于9:00 至11:00 测定各处理的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2 浓度(Ci)、饱和大气压差(VPD)、叶温(CTleaf)等气体交换参数。每处理测定三盆,每盆测试3 片相同节位的叶片,以3 片叶的各参数平均值为1 个重复,共3 次重复。计算瞬时水分利用效率(WUEi = Pn / Tr),气孔限制值[Ls = (1-Ci/Ca)×100],非气孔限制值(Ci/Gs)。

7.1.2.2 叶绿素荧光参数的测定

采用FMS-2 便携脉冲调制式荧光仪进行测定。测定前选取植株的中间叶片,用特制的暗适应夹对叶片进行充分暗适应后测定叶片的初始荧光(Fo),再用饱和的白光照射1s,测得最大荧光(Fm)和PS Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm),计算PS Ⅱ潜在活性(Fv/Fo),然后用活化光对暗适应的叶片进行20 min 光处理,测定光适应下稳态荧光产量(Fs)、最大荧光产量(Fm’)、PS Ⅱ实际光化学量子产量(Yield)等参数。每个处理测定6 株,每株1 个叶片,各荧光参数重复记录6 次。然后计算光化学淬灭系数[qP =(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo)]和非光化学淬灭系数(NPQ = Fm / Fm’-1)。

7.1.2.3 叶绿素含量测定

参照丙酮提取法提取测定植物叶片叶绿素和类胡萝卜素(张志良和瞿伟菁,2009)。(www.chuimin.cn)

7.1.2.4 叶片超显微结构的观测

参照万里强等(2009)、刘艳等(2010)和康萨如拉等(2013)的方法,略有修改。

在干旱胁迫处理60 d 后,选择晴朗的天气,在上午8:00-9:00 对各处理植物叶片进行取样。每处理选取生长状况基本一致的植株6 株,每一植株上取2 片中上部的功能叶片。4℃冷藏迅速带回实验室后,用锋利的双面刀片沿叶片主脉中部横切成约1 cm×0.5 cm 大小的长方形小块,立即用配制好的4 %戊二醛前固定液于4℃下固定3 h,之后用0.1 M的二甲硫砷酸钠溶液洗涤3 次,间隔2 h 更换一次洗涤液。然后在4℃下用1%的锇酸后固定液固定2 h,经0.1M 的二甲硫砷酸钠溶液冲洗两次,每次间隔15 min,于室温下进行系列梯度酒精脱水,环氧树脂Epon812 渗透与包埋,并在60℃恒温箱中聚合48 ~72 h。

将包埋好的植物叶片在莱卡UC-6 型超薄切片机上进行半薄切片制作,切片厚度2 ~4μm。在光学显微镜下对试验材料进行定位,以确定需要观察的结构部位。定位后利用莱卡UC-6 型超薄切片机切片,超薄切片厚度为70 ~80 nm,经醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色后,在JEM-2100HC 透射电子显微镜上观察和拍照。