烟草废弃物：废弃利用与综合研究

2023-10-28 理论教育版权反馈

【摘要】：广西贺州烟草花蕾精油对三种细菌的抑菌圈直径处于22.19～50.15，均属最敏感，且对大肠杆菌的抑菌能力最强。综合比较来看，云南文山烟草花蕾精油的抑菌性能最好，其次广西贺州烟草花蕾精油。同时，从表5-13中还可以看出，四种产地的烟草花蕾精油对真菌的抑菌效果无明显差异，抑菌效果较差。

5.2.1.1 试验方法

（1）培养基的配制

肉汤固体培养基：称取25g肉汤培养基，18g琼脂，加入1000mL蒸馏水，加热溶解后，分装，121℃高压灭菌15min，备用。用于细菌的培养和抑菌试验。

PDA固体培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮，切碎，加入1000mL蒸馏水，煮30min，待马铃薯煮化后，用8层纱布过滤。然后再加入20g蔗糖，18g琼脂，充分溶解后，分装，121℃高压灭菌15min，备用。用于霉菌和毕赤酵母的培养和抑菌试验。

其中，制作液体培养基时，不加入琼脂。

（2）菌悬液的制备将待试菌种活化后，用生理盐水配制成菌悬液。采用平板计数法测定细菌菌悬液的菌体个数，选用含菌体浓度为10⁶～10⁷cfu/mL的菌悬液，真菌采用显微镜直接计数法测定菌体个数，选用含孢子浓度为10⁶～10⁷个/mL的菌悬液，备用。

（3）抑菌性能的测定采用滤纸片法测定精油的抑菌性能。用打孔器将滤纸切割成直径为6mm的小圆型纸片，然后置于干燥的试管中，121℃灭菌30min后，在无菌操作台上将其放入浓度为140mg/mL的精油—乙醇溶液中。用无菌移液枪吸取0.2mL含菌体浓度为10⁶～10⁷cfu/mL的菌悬液，滴加到新鲜无菌的固体培养基上，涂布均匀。用无菌镊子将浸有精油的滤纸片贴在固体培养基中心，每个菌种平行测定3次。恒温培养（细菌：37℃/24h；真菌：28℃/48h），测定抑菌圈直径，比较抑菌效果。采用3mg/mL的青霉素钠和10mg/mL的头孢噻肟钠作为阳性对照。测定抑菌圈直径，比较抑菌效果。

（4）最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）采用倍比稀释法在96孔板中测定最小抑菌浓度（MIC）。首先第一列八个孔分别加入200μL液体培养基做空白对照，第二列加入180μL液体培养基和20μL浓度为30mg/mL的烟草花蕾精油，从第三列到第十一列均加入100μL的液体培养基。从第二列中分别吸取相应的100μL精油到对应的第三列各孔，依次稀释到第十一列，最后从第十一列中吸出100μL废弃。各列精油的浓度为（14、7、3.5、1.75、0.875、0.4375、0.2188、0.1094、0.0547、0.0273mg/mL）。最后向第二到十一列各孔加入100μL菌悬液，其中第四行加100μL培养液做对照，第十二列各孔加200μL菌液做阴性对照，细菌的第四行以3mg/mL的青霉素钠的倍比稀释做阳性对照，真菌不做阳性对照。（细菌37℃/24h；真菌30℃/48h）。

在MIC和MFC（最小杀真菌浓度）测定试验中，将无菌生长的液体培养基中取出20μL涂布平板，继续培养（细菌37℃/24h；真菌30℃/48h）。观察有无菌落生长。无菌落生长的最小浓度即为MBC或MFC。MIC和MBC的试验中，为了保证精油与培养液的互溶性，需在培养液中加入1%（体积分数）的吐温80做乳化剂。

5.2.1.2 抑菌圈直径试验结果

不同产地烟草花蕾精油以及青霉素钠、头孢噻肟钠对不同微生物的抑菌圈测定，如表5-13所示。

表5-13 不同产地烟草花蕾精油的抑菌圈直径单位：mm

注：青霉素钠和头孢噻肟钠为真菌产生的抗生素，对细菌有抑菌作用，因此未对其进行真菌抑菌性试验。

从表5-13中可以看出四种产地的精油对细菌均有一定的抑菌性。重庆奉节烟草花蕾精油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和多黏类芽孢杆菌的抑菌圈直径处于21.34～32.84，均属最敏感，且对枯草芽孢杆菌的抑制最强。贵州正安烟草花蕾精油对多黏类芽孢杆菌的抑菌圈直径为12.75±3.30，属中度敏感，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为19.75±8.13，属中高度敏感，而对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为26.25±6.01，属最敏感。广西贺州烟草花蕾精油对三种细菌的抑菌圈直径处于22.19～50.15，均属最敏感，且对大肠杆菌的抑菌能力最强。云南文山烟草花蕾精油对三种细菌的抑菌圈直径处于30.30～60.92，均属最敏感，且对大肠杆菌的抑菌能力最强。四种产地的烟草花蕾精油对黑曲霉、青霉和毕赤酵母的抑菌圈直径处于6.47～9.62，属于低度敏感，而对毛霉的抑菌圈直径均为0，没有抑菌性，因而对毛霉不敏感。

综合比较来看，云南文山烟草花蕾精油的抑菌性能最好，其次广西贺州烟草花蕾精油。抑菌效果最差的是贵州正安烟草花蕾精油。同时，从表5-13中还可以看出，四种产地的烟草花蕾精油对真菌的抑菌效果无明显差异，抑菌效果较差。尤其是对毛霉没有抑菌效果。

5.2.1.3 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）

不同产地烟草花蕾精油以及青霉素钠对不同微生物的最小抑菌浓度（MIC）以及最低杀菌浓度（MBC）测定，如表5-14和表5-15所示。

表5-14 不同产地烟草花蕾精油的最小抑菌浓度（MIC）单位：mg/mL

表5-15 不同产地烟草花蕾精油的最小杀细菌浓度（MBC）和最小杀真菌浓度（MFC）单位：mg/mL

注：青霉素钠为真菌产生的抗生素，对细菌有抑菌作用，因此未对真菌进行MIC和MBC试验。(www.chuimin.cn)

由表5-14和表5-15可知，不同产地烟草花蕾精油对细菌和真菌都具有一定的抑菌能力。其中云南文山烟草花蕾精油对大肠杆菌的抑菌效果最好。其最小抑菌浓度（MIC）为1.75mg/mL，最小杀菌浓度为3.5mg/mL。其次，抑菌效果较好的是重庆奉节和广西贺州烟草花蕾精油，其中重庆奉节烟草花蕾精油对枯草芽孢杆菌的抑菌效果较好，而广西贺州烟草花蕾精油对多黏类芽孢杆菌的抑菌效果较好，两者的MIC和MBC均为3.5mg/mL。四种不同产地的烟草花蕾精油对真菌的抑菌效果均较差，尤其是对于青霉的抑菌效果最差，其最小杀菌浓度均大于或等于14mg/mL。

5.2.2.1 试验方法

（1）·DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）清除能力测定用50%的无水乙醇分别配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL的烟草花蕾精油、BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚溶液）溶液作为样品溶液。样品溶液取1mL，分别加入50μL吐温80，然后再加入2mL浓度为1mmol/L的DPPH溶液（50%乙醇溶解）在暗处放置0.5h，然后在517nm处测吸光度A。对照组用蒸馏水代替各个样品，重复上述操作，在517nm处测吸光度为A₁，空白组用50%乙醇代替DPPH溶液，重复上述操作，在517nm处测吸光度A₀。每组试验设三组平行试验。·DPPH清除率如式（5-2）所示。

（2）还原能力测定用50%的无水乙醇分别配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL的烟草花蕾精油、BHT溶液作为样品溶液。样品溶液取0.5mL，分别加入50μL吐温80，然后再加入2.5mL的PBS缓冲溶液（磷酸盐缓冲液）（pH为6.6），2.5mL 1%的铁氰化钾（质量分数），50℃水浴锅恒温水浴30min，然后置于冰水中快速冷却。再分别加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1%的三氯化铁溶液（质量分数），3000r/min离心后静置10min，在700nm处测吸光度A。空白组用蒸馏水代替铁氰化钾和三氯化铁溶液，重复上述操作，在700nm处测吸光度A₀。每组试验设三组平行试验。

还原能力的大小用吸光度（A-A₀）表示。

（3）清除OH自由基用50%的无水乙醇分别配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL的烟草花蕾精油、BHT溶液作为样品溶液。取样品溶液0.5mL，分别加入50μL吐温80，1mL PBS缓冲溶液（pH为7.4），1mL浓度为7.5mmol/L的邻二氮菲溶液，1mL浓度为3.25mmol/L的硫酸亚铁溶液，2mL浓度为1.5%的双氧水，充分混合后于37℃下放置1h，在536nm处测吸光度A。对照组用蒸馏水代替各个样品，重复上述操作，在536nm处测吸光度A₁，空白组用蒸馏水代替邻二氮菲、硫酸亚铁溶液和双氧水，重复上述操作，在536nm处测吸光度A₀。每组试验设三组平行试验。·OH清除率如式（5-3）所示。

（4）清除O^2-自由基用50%的无水乙醇分别配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL的烟草花蕾精油、BHT溶液作为样品溶液。样品溶液取1mL，分别加入50μL吐温80，4.5mL浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液（三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液）（pH为8.2），1mL浓度为1mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）溶液，0.4mL浓度为25mmol/L的邻苯三酚溶液，置于25℃水浴锅中恒温4min后，迅速用1mL浓度为12mol/L的HCl终止反应。在320nm处测吸光度A。对照组用蒸馏水代替各个样品，重复上述操作，在320nm处测吸光度A₁。空白组用蒸馏水代替EDTA、邻苯三酚和HCl溶液，重复上述操作，在320nm处测吸光度A₀。每组试验设三组平行试验。超氧阴离子清除率如式（5-4）所示：

5.2.2.2 不同产地烟草花蕾精油对·DPPH清除能力测定

如图5-6所示，四种产地的烟草花蕾精油与BHT均具有一定的清除· DPPH能力且·DPPH清除能力随着浓度的增加均有所变化。其中BHT随着浓度的增加，·DPPH清除率呈直线上升。贵州正安烟草花蕾精油在浓度0.5～1.0mg/mL范围内快速增长，其后基本保持不变。重庆奉节烟草花蕾精油和广西贺州烟草花蕾精油随着浓度的增大，·DPPH清除率缓慢增加。而云南文山烟草花蕾精油的· DPPH清除率随着浓度的增加，在1.5mg/mL处略有回落，随后又继续增长。从图5-6中还可以看出，在浓度高于1mg/mL时，贵州正安烟草花蕾精油的·DPPH清除能力高于其他三种烟草花蕾精油。当浓度达到2.0mg/mL时，四种烟草花蕾精油清除· DPPH的能力相差不大，均可以达到BHT的一半左右。整体上在浓度为0.5～2.0mg/mL范围内，四种烟草花蕾精油清除·DPPH的能力大小为：贵州正安＞重庆奉节＞广西贺州＞云南文山。

图5-6 不同产地烟草花蕾精油的·DPPH清除率图

5.2.2.3 不同产地烟草花蕾精油还原能力测定

从图5-7中可以看出，四种烟草花蕾精油与BHT均有一定的还原能力，且均随着浓度的升高，还原能力增强，但增加速率不同。其中BHT＞贵州正安＞重庆奉节＞云南文山＞广西贺州，四种烟草花蕾精油的还原能力在0.5mg/mL时，最接近BHT。在浓度为2.0mg/mL时，四种烟草花蕾精油的还原能力达到最大，BHT的吸光度为0.453±0.005，贵州正安烟草花蕾精油的吸光度达到BHT的一半，为0.235±0.004，重庆奉节烟草花蕾精油的吸光度为0.149±0.018，云南文山烟草花蕾精油的吸光度为0.110±0.002，广西贺州烟草花蕾精油的还原能力最低，吸光度为0.101±0.001。

图5-7 不同产地烟草花蕾精油的还原能力图

5.2.2.4 不同产地烟草花蕾精油对OH自由基的清除能力

如图5-8所示，四种产地的烟草花蕾精油与BHT均有一定的OH自由基清除能力。BHT的OH自由基清除能力在浓度1.5mg/mL时，略有升高，随后基本保持不变。由图5-8中可以看出，重庆奉节烟草花蕾的OH自由基清除能力在浓度低于1.5mg/mL时，均高于BHT，在浓度为2.0mg/mL时，与BHT无明显差异。广西贺州和云南文山的烟草花蕾精油在浓度为0.5mg/mL和1.0mg/mL时的OH自由基清除能力高于BHT，在浓度为1.5和2.0mg/mL时，与BHT无明显差异。贵州正安烟草花蕾精油的OH自由基清除能力，除在1.0mg/mL时，与BHT无明显差异外，均低于BHT。四种烟草花蕾精油的OH自由基清除能力大小为：重庆奉节＞云南文山＞广西贺州＞贵州正安。

图5-8 不同产地烟草花蕾精油的OH自由基清除率图

5.2.2.5 不同产地烟草花蕾精油对O^2-自由基的清除能力

由图5-9可以看出，四种烟草花蕾精油均具有一定的O^2-自由基清除能力，且随着浓度的升高而增大。其中，广西贺州烟草花蕾精油的O^2-清除能力最好，在 1.0mg/mL时接近BHT，在 2.0mg/mL时达到最大，为38.57% ± 0.27%。重庆奉节烟草花蕾精油的O^2-清除能力较其他几种精油差，尤其是在浓度为0.5mg/mL时，清除率仅有17.20% ± 0.19%，但是随着浓度的增大，清除能力逐渐增大，在浓度为2.0mg/mL时，达到35.37% ± 1.27%。

图5-9 不同产地烟草花蕾精油的O^2-自由基清除率图

烟草废弃物：废弃利用与综合研究

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