酶解条件对烟叶蛋白水解度的影响

2023-10-28 理论教育版权反馈

【摘要】：加酶量对蛋白质水解度的影响：将酶解温度设置为50℃，酶解时间2h，加酶量分别为2%、3%、4%、5%、6%，其他条件与上述相同。胰蛋白酶组中烟叶蛋白质的水解度2h以后几乎不变，最适酶解时间为2h。木瓜蛋白酶组在酶解时间为0.5h时，烟叶蛋白水解度已经达到较高的水平39.65%。

试验分为三个组，分别为胰蛋白酶组、木瓜蛋白酶组、复合蛋白酶组，每组再分别进行酶解单因素试验。

温度对蛋白质水解度的影响：取60mg烟叶蛋白质，加入3mL水溶解，调pH到每组不同酶的最适值，分别为胰蛋白酶pH为10，木瓜蛋白酶pH为7，复合蛋白酶pH为7，预热5min，对应加入3%的不同的酶，酶解时间2h，温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃进行反应。

时间对蛋白质水解度的影响：将酶解温度设置为50℃，酶解时间分别为0.5h、1h、2h、3h、4h，其他条件与上述相同。

加酶量对蛋白质水解度的影响：将酶解温度设置为50℃，酶解时间2h，加酶量分别为2%、3%、4%、5%、6%，其他条件与上述相同。

pH对蛋白质水解度的影响：将酶解温度设置为50℃，酶解时间2h，加酶量3%，胰蛋白酶组pH分别为7、8、9、10、11、12，木瓜蛋白酶组pH分别为5、6、7、8、9，复合蛋白酶组pH分别为4、5、6、7、8、9，其他试验条件与上述相同。

完全水解蛋白液的制备：取烟叶蛋白100mg，放入40mL耐压瓶中，加入5mL 6mol盐酸，拧紧瓶盖，110℃油浴中水解24h，冷却，过滤，滤液旋转蒸发至蒸干，加蒸馏水50mL左右，用1mol/L NaOH中和至pH为6，定容至100mL。

烟叶蛋白质水解液水解度的测定：试验组：取烟叶完全水解蛋白液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于试管中，蒸馏水补至4.0mL，加pH8缓冲溶液1.0mL，茚三酮溶液1.0mL，混匀，沸水浴加热15min，冷却，蒸馏水稀释至10mL，570nm测定吸光度（水作参比）。对照组：另取100mg蛋白，加水100mL，振荡均匀后过滤，取相应体积的滤液，按上述方法测定吸光度值。相同体积样品的吸光度之差与烟叶蛋白的质量做工作曲线，取线性部分做标准曲线。

水解液水解度的测定：取水解后灭酶的水解液1mL，稀释至50mL，过滤，取滤液1mL，加水至4mL，上述茚三酮法反应，570nm处测定吸光度值（水作参比）。另取同种未水解烟叶蛋白溶液1mL，按上述方法测定吸光度，以二者吸光度之差从烟叶蛋白水解液中蛋白质浓度与吸光度标准曲线上计算得到蛋白质含量，计算水解度（DH），如式（4-1）所示：

式中 A——计算得到蛋白质的质量，mg；(www.chuimin.cn)

W——称样重，g；

V₁——水解液的总体积，mL。

图4-1为不同酶解条件对烟叶蛋白水解度的影响，其中（1）为温度对烟叶蛋白水解度的影响，（2）为酶解时间对烟叶蛋白水解度的影响，（3）为加酶量对烟叶蛋白水解度的影响，（4）为pH对烟叶蛋白水解度的影响。

图4-1（1）中胰蛋白酶对蛋白质的水解度随酶解温度的升高先增加后减少，在50℃左右达到最高值34.40%，木瓜蛋白酶在50℃左右达到最高值41.72%，复合蛋白酶在40～60℃范围内对烟叶蛋白质的水解变化不明显，从节约能源考虑，取40℃为最适温度。

图4-1（2）中随酶解时间的延长，三种酶对烟叶蛋白的水解度都有所增加。胰蛋白酶组中烟叶蛋白质的水解度2h以后几乎不变，最适酶解时间为2h。木瓜蛋白酶组在酶解时间为0.5h时，烟叶蛋白水解度已经达到较高的水平39.65%。复合蛋白酶组烟叶蛋白的水解度在3h后达到较高水平43.99%，需要的反应时间比较长。

图4-1（3）可以看出胰蛋白酶的最适加酶量均为底物质量的5%，木瓜蛋白酶为3%，复合蛋白酶为5%。

图4-1（4）看出胰蛋白酶的最适pH为10，木瓜蛋白酶的最适pH为8，复合蛋白酶的最适pH为7。

图4-1 不同酶解条件对烟叶蛋白水解度的影响

酶解条件对烟叶蛋白水解度的影响

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