对烟秆多糖进行酸水解,然后进行HPLC单糖分析,方法见多糖样品处理章节。由之前的紫外检测表明烟秆多糖中含有蛋白质,从而推测烟秆多糖为结合少量蛋白质β-构型的吡喃杂多糖。从表2-2中可以看出烟秆多糖的Mw为3.142 × 104。烟秆多糖中的dn=1.247,接近于1,说明多糖分子的质量分布较窄,均一性较好。图2-5 烟秆多糖Mw、LS和dRI与流出时间的关系图图2-6 烟秆多糖均方根旋转半径与重均分子质量双对数关系图......
2023-10-28
1.2.1.1 多糖样品的处理
准确称取1.0mg精制烟叶多糖,加入3mL 2mol/L的三氟乙酸,密封置于100℃水浴锅中恒温水解2h,冷却;转移至烧瓶中60℃旋转蒸发,蒸干(蒸馏瓶中无液体)后再加入2~3mL蒸馏水,再次蒸干;重复3次,最后加入1mL超纯水溶解,用0.45μm聚醚砜滤膜过滤,转移至色谱瓶中,进行HPLC检测。检测条件如下所述。
色谱柱:Aminex HPX-87H柱;柱温:50℃;流动相:5mmol/L硫酸溶液(超声波脱气15min);流速:0.6mL/min;检测器:示差折光检测器;进样量:20μL。
混合标准样品溶液的配制:根据预试验结果,选定并准确称取葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖各0.1g,分别用超纯水溶解并定容至50mL;各取0.1mL每种糖溶液至同一个色谱瓶中,用超纯水补至1.5mL作为混合标准溶液,HPLC进样检测,条件与检测烟叶多糖样品时相同。
1.2.1.2 多糖的单糖组成分析
将烟叶多糖酸水解,然后HPLC分析其单糖组成,根据标准样品的保留时间确定多糖水解样品中含有的单糖分别为葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖,其质量分数如表1-1所示。可以看出,烟叶多糖是一种酸性杂多糖。
表1-1 烤烟上部烟叶多糖的单糖组成
烟叶多糖的红外光谱图如图1-1所示。通过分析可知,—OH的O—H伸缩振动在3350cm-1形成吸收峰;在2920cm-1处出现的较强吸收峰,是CH3或CH2的C—H伸缩振动峰;1630cm-1为C═O的伸缩振动吸收峰;吡喃环内CH2对称伸缩振动峰以及OH面内变形振动峰(1410cm-1左右)、C—O键的伸缩振动峰(1040cm-1左右),表明为典型的吡喃糖结构;890cm-1左右为β-构型多糖的特征吸收峰。综上,推测出烟叶多糖为酸性β-吡喃糖。
图1-1 烤烟上部烟叶多糖的红外光谱图(www.chuimin.cn)
图1-2是烟叶多糖重均分子质量(Mw)、光散射信号(LS)和示差信号(RI)与流出时间的关系图。其中Mw与流出时间的关系曲线表示一定时间段内多糖的重均分子质量大小;LS与流出时间的关系曲线表示不同流出时间的多糖粒径大小;RI与流出时间的关系曲线表示不同流出时间的多糖溶液浓度。可以从黑线曲线看出多糖的重均分子质量主要分布在11000~130000g/mol。采用Astra 4.72软件(美国怀亚特技术公司)进行数据处理,计算样品的分子质量大小和均方根的回转半径。均方根旋转半径对重均分子质量(Mw)的依赖关系可用关系式表示,该关系式的α值也可用于推断高分子在溶液中的链构象。α值接近1、0.5和0.33时,分别表示高分子在溶液中呈现刚性棒状链、无规线团和球形链构象。通过取对数可将关系式转化为线性方程,其中lgK为y轴上截距,α为直线斜率。通过软件分析得到表1-2的结果,其中烟叶多糖的Mw为6.587 × 104;烟叶多糖的多分散系数Mw/Mn为1.557,其越接近1,试样越均一,也就是说提取的烟叶多糖分子质量分布较窄,均一性较好。由表1-2数据,Mw很大,而旋转半径相对较小,推断多糖形状为球型。进一步论证,将烟叶多糖与Mw的双对数作图,得到图1-3,Mw<30000g/mol时为部分Ⅰ,Mw>30000g/mol时为部分Ⅱ,当Mw小于30000g/mol(或均方根旋转半径小于10nm)时不适合均方根旋转半径与重均分子质量双对数关系模型,不做讨论。对Ⅱ部分的双对数模型进行直线拟合,得到的直线斜率α为0.279。可知,多糖在水中的构象为球型,并且推测其为高度支化。
表1-2 SEC/MALLS/RI测定的烤烟上部烟叶多糖的相关分子参数
注:∗Mn为数均分子质量,Mp为峰值分子质量,Mw为重均分子质量,Mz为均分子质量,Mw/Mn为多分散系数,为均方根旋转半径。
图1-2 上部烟叶多糖重均分子质量(Mw)、光散射信号(LS)和示差折光信号(RI)与流出时间的关系
图1-3 烟叶多糖均方根旋转半径与重均分子质量的双对数关系
由表1-3可以看出,在无氧条件下,上部烟叶多糖在600℃裂解时鉴定出17种组分,主要为乙酸、糠醛、糠醇、甲基环戊烯醇酮、苯酚、乙二醇二乙酸酯、4-羟基丁酸内酯、2-羟基茉莉酮等,在900℃裂解时鉴定出21种组分,主要为乙醛、甲苯、3-甲基吡咯、2-甲基吡啶、乙苯、吡啶、苯乙烯、N-乙基吡咯、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、间乙基甲苯、苯酚、邻甲酚等。不同温度下的热裂解成分差异较大,仅有苯酚、甲基环戊烯醇酮和己二酸二(2-乙基己)酯三种成分相同。
表1-3 烤烟上部烟叶多糖在无氧条件和不同温度下的裂解产物
续表
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