传染病流行病学研究方法-第二节

2023-08-13 理论教育版权反馈

【摘要】：与传统流行病学调查研究的区别在于，传染病血清流行病学调查研究中要兼顾人群血清学检测的特殊技术。在许多病例对照研究或队列研究等分析性流行病学研究或现场试验中，常常结合应用血清学技术调查人群对疾病某危险因素的暴露状况与发病的关系。另外，传染病血清流行病学研究还采用基于双份血清检测的横断面调查研究。3样本量估计传染病血清流行病学抽样方法与样本大小取决于研究类型、调查目的与方法。

1　调查方法

传染病血清流行病学是应用血清学技术进行流行病学调查，所以需要遵循流行病学的基本原理与方法，其调查设计的原则、要点和资料信息的收集、分析仍应遵照流行病学的基本要求，主要的调查研究设计方法也包括横断面研究和前瞻性研究。与传统流行病学调查研究的区别在于，传染病血清流行病学调查研究中要兼顾人群血清学检测的特殊技术。

1.1　横断面调查

横断面研究（cross-sectional study）最为常用，主要应用于两种情况。一种情况是在特定的、很短的时间内对一个地区或单位人群随机抽取具有代表性的人群样本，调查某种传染病病原体抗体的阳性率，以掌握人群某种抗体、抗原水平及其他血清标志物含量的状况，了解该病的人群免疫水平。另一种情况是在同一时间对不同地区或单位人群血清抗体阳性率的调查，用于研究血清抗原、抗体水平与一些因素（如年龄、性别、地区、生活方式等）之间的关联，以发现病原体感染的危险因素。

在许多病例对照研究或队列研究等分析性流行病学研究或现场试验中，常常结合应用血清学技术调查人群对疾病某危险因素的暴露状况与发病的关系。这类研究需要进行血清学指标的检测，用血清学指标作为主要研究变量。从血清流行病学角度，这类研究也被称为专项调查。

另外，传染病血清流行病学研究还采用基于双份血清检测的横断面调查研究。这种研究主要是为了对流行或暴发的传染病病因做出初步诊断。其方法是在疾病流行时收集患者急性期和恢复期的双份血清标本进行检测。如果大多数患者的恢复期血清某病原体的抗体效价与急性期相比增加4倍或4倍以上，则认为该病原体很有可能是本次疾病流行或暴发的病因。

1.2　前瞻性研究

传染病血清流行病学的另一个主要研究设计方法是前瞻性研究（prospective study），包括大样本重复横断面调查和队列研究。

（1）重复横断面调查

重复横断面调查是指在一定时间内，对某个特定人群进行多次重复的横断面调查。大样本重复调查主要用于追踪观察传染病的发病情况，可通过比较同一调查人群两次检测的血清阳性率的变化来估计某一特定时间内该人群的发病情况。

重复横断面调查的最大优点是可以不必对人群进行连续监测，而且不会漏掉正处于亚临床阶段的病例。另外，可以对某一人群每隔一定时间进行血清抗体随访调查，观察某种传染病的动态感染率、抗体的动态变化及转归、免疫水平的长期变迁及不同种类抗体的消长规律，也可以研究隐性感染者抗体水平与以后感染率的关系。这种重复调查方法可以用来了解不同时间内的人群或地区的抗体等血清标志物的分布和变化情况，为制定防制规划与措施提供参考依据。另外，重复横断面调查还可以用来验证某种与发病有关的因素是否恒定地存在或变化。

（2）队列研究

队列研究（cohort study）是最为常用的分析性流行病学研究方法。它是根据疾病相关的某种血清学指标将研究对象分为暴露组和非暴露组，跟踪观察一段时间，比较两组的发病率，以探讨该因素与观察结局的关系。

为验证乙型肝炎病毒（HBV）感染与肝癌的因果关系，根据HBsAg检测结果将人群分为暴露组（HBsAg阳性者）和非暴露组（HBsAg阴性者），跟踪随访10年，观察比较两组肝癌的发病率。结果显示，HBsAg阳性者易患肝癌的危险性是HBsAg阴性者的11.8倍（表13-1）。

表13-1　HBV感染与肝癌关系的队列研究

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［引自：陆建华，等.HBsAg携带状态与肝癌关系的十年随访研究［J］.中华预防医学杂志，1988，22（5）：259.］

2　调查对象

根据调查的目的和要求，应明确是对一个地区的全体人群的调查，还是对其中一部分人进行调查，确定具有代表性的人群。在目标人群中以随机抽样的原则选择调查对象。调查对象还应排除近期使用过免疫球蛋白、抗生素及各种免疫抑制剂者，以免干扰血清学检测结果。

当血清学调查用于传染病的患病群体时，可以把临床诊断明确的患者作为调查对象，采集其急性期和恢复期双份血清或不成对血清。若要了解感染后机体免疫持续时间，则应选择显性感染患者进行纵向观察。如果是调查某种传染病的隐性感染率，则选择既往无该病罹患史，目前也无特异症状和体征，且未接种过该病疫苗的自然人群进行横断面（时点）调查。

考核评价某传染病的预防接种效果时，可选择该病的易感者（如低年龄组、既往无该病病史、未接种过该病疫苗、血清抗体阴性者）为调查对象。按照随机原则分为两组，一组作为对照，另一组接种疫苗，然后在疫苗接种前与疫苗接种后的不同时间定期采血观察两组的血清抗体产生和持续时间等信息。

在实际工作中，有时选择具有代表性的人群难以实现，根据调查目的可选择某些特殊来源的血清作为检测样本，比如各种健康检查（新兵入伍、妊娠期检查、产前检查等）、献血员献血、住院患者入院检查等。

3　样本量估计

传染病血清流行病学抽样方法与样本大小取决于研究类型、调查目的与方法。除了考虑统计效能等问题外，由于血清学调查涉及现场调查的可行性与实验室检测的工作量，因此估算样本大小时，既要保证研究质量，又要考虑现场的工作条件和成本等，通常样本量不宜过大。

如果研究的是患病后免疫的持久性，则选择30～50人即可。如果要研究人群中是否存在某传染病的抗体，可采集25～100人的样本。在调查一个地区某种传染病的人群免疫水平时，通常是将调查对象按年龄分组，再在各年龄组随机抽样。如果该地区人口较多，为节省人力、物力，可考虑分阶段抽样。根据WHO推荐，在一个人口5万人以上的地区，其抽样人数以300～600人为宜。

4　调查内容

血清流行病学调查除应采集血液标本外，还应取得相应的流行病学资料。调查项目可根据调查目的和病种确定，调查内容或项目力求精练，不宜过多。

一般项目包括姓名、性别、出生日期、民族、职业、以往与现在的住址等。家庭或单位成员及年龄、生活住房间数及面积、卫生状况、饮用水源、饮食及粪便污物处理情况、宠物饲养、户外活动等。发病信息包括发病日期、主要临床症状及体征、临床诊断、诊断依据及诊断单位、既往相关患病史、抗生素等药物的使用情况等。预防接种种类、时间、剂量，生物制品或药物使用情况，有关危险因素接种史等。另外还须记录调查者姓名、调查日期、调查地点等。

5　血清标本的采集、运送与保存

血清样本是传染病血清流行病学研究中的关键材料。血清标本的采集、运送和保存是否符合要求会直接影响血清学检测结果，从而影响研究的成败。血清标本的采集、运送和保存应始终保持无菌。采集应在无菌环境下静脉抽血3～5 mL，不加抗凝剂。如果是微量法（特别对婴儿），可从耳垂、手指尖和脚跟采血0.3～0.5 mL。

运送过程中保持无菌、低温。标本放置时间不宜过长，一般不超过10小时，最长不超过20小时。

从标本中分离出的血清，短期保存1～2周可放置在4℃条件下，长期保存则应放置在－20℃条件下。为防止血清成分在长期保存中变性，应将血清标本放置在－70℃条件下。

6　主要血清学试验方法

血清流行病学实验室检测的工作量大，影响因素多。在选择血清学试验方法时，既要考虑方法的灵敏度、特异度、准确性、重复性，又要求试验方法具有简便、经济、安全、标准化和自动化程度高等特点，同时还应考虑实验室的现有条件。用于检测血清中免疫学标志物的试验方法很多，现将常用方法简介如下。

6.1　凝集试验

凝集试验（agglutination test）是传染病血清流行病学调查中较常用的抗体检测方法。颗粒抗原与相应抗体直接结合形成可见的凝集块为直接凝集试验。主要有玻片法和试管法。玻片法是指抗原和相应抗体在玻片上进行凝集反应的方法，用于定性检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定等。试管法是指在试管中倍比稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原进行凝集反应的方法，用于定量检测抗体，如诊断伤寒病的肥达试验。

将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。当可溶性抗原中加入相应抗体时，凝集反应即可受到抑制，则称为凝集抑制试验（agglutination inhibition test）。

根据所用载体的不同，凝集试验又可分为血凝试验（hemagglutination test）、乳胶凝集试验（latex agglutination test）、葡萄球菌蛋白A试验（staphylococcal protein A test）等。其中，用血凝试验检测血清抗体在传染病血清流行病学中最为常用。

6.2　酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）具有简便、经济、灵敏度高等优点，无须特殊设备，在血清流行病学中应用最为广泛，是如今检验科常用的免疫学检测方法之一。

ELISA的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合。试验前，将少量纯化抗原结合在微孔塑料板等固相表面；另将人免疫球蛋白（含多种抗体的混合物）接种给兔、山羊等实验动物，诱导其产生抗人免疫球蛋白抗体，再用化学方法使之与某种酶连接成酶标记物。检测时，依次加入受试的血清标本和酶标记物。如果血清中含有特异抗体，即能与特异抗原结合，洗板后，未能结合的成分即被清除。然后加入酶反应底物，在酶的作用下生成有色产物，根据颜色的有无、深浅即可定性或定量地检测血清中待检的抗体。

ELISA主要包括间接ELISA、双夹心ELISA、酶标抗原竞争ELISA等。

6.3　免疫荧光试验

免疫荧光试验（immunofluorescence test）是一种免疫标记技术，是将血清学的特异性与荧光素的敏感性、可见性相结合的一项血清学检测技术。利用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反应，形成镜下可见抗原抗体复合物。在荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原进行鉴定或定位。

此外，常用的血清抗体检测方法还有中和试验沉淀反应、补体结合试验，常用的细胞免疫试验方法有淋巴细胞计数、E玫瑰花环试验、巨噬细胞移动抑制试验、皮肤试验等。

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