创业机会评估方法主要分为定性评估法、定量评估法以及定性与定量评估相结合的评估方法。（一）定性评估法定性评估法主要有史蒂文森法和隆杰内克法。（三）定性与定量相结合的评估方法这类评估的方法主要有蒂蒙斯的创业机会评价框架，[14]创业者在采用该方法时需要对经济因素、竞争优势、致命缺陷问题等8 个方面进行评估，一共有55 个指标，几乎涵盖其他评价方法的全部评价因素。......
2023-08-31
UPLC-UV/CD定性、定量测保健品游离氨基酸对映体
【摘要】：为了鉴定保健品中含有的游离态氨基酸是天然的还是合成的，就要用CD检测仪，CD是circular dichroism 的缩写，中文就是圆偏振光二色光谱。为了能同时测出样品中总的氨基酸含量及L／D的比例，可以作如下的工作曲线。有了工作曲线，根据CD面积与UV面积的比值，就可以知道样品中L型氨基酸的百分含量。5%D型），但氨基酸的总量不变。
具有光学活性的分子在溶液中对左旋光及右旋光的吸收度不一样，由此产生的偏差可以用来确定D或L的对映分子。天然的来自蛋白质分解而得的氨基酸是L型的，合成的氨基酸是D型的。为了鉴定保健品中含有的游离态氨基酸是天然的还是合成的，就要用CD检测仪，CD是circular dichroism 的缩写，中文就是圆偏振光二色光谱。
图5-2是6个氨基酸的UV 图像，峰面积的大小与D／L分子的总和成正比。图5-3是L型分子的CD图像，显正峰峰面积与L型分子成正比；图5-4是D型分子的CD图像，显负峰峰面积与D型分子成正比。但假如样品中的氨基酸50%是L型，另外50%是D型，那么由于正负抵消，成为外消旋，所以CD的图像就是一条直线，如图5-5所示，但是UV 图像还是一样，峰面积与D／L比例无关。
图5-2 50 mg／50 mL氨基酸水溶液的UV色谱图
图5-3 L型分子的CD色谱图
假如样品中的氨基酸有95%是L型，5%是D型，UV 的峰面积仍不变，但是CD的L型分子图像的峰面积只有原来纯L型的90%。
为了能同时测出样品中总的氨基酸含量及L／D的比例，可以作如下的工作曲线。图5-6是以CD峰面积／UV 峰面积作纵坐标，以样品中D%作横坐标，得到的工作曲线。有了工作曲线（暂且称为氨基酸对映体百分含量工作曲线），根据CD面积与UV面积的比值，就可以知道样品中L型氨基酸的百分含量。
图5-4 纯D型分子的CD色谱图
图5-5 氨基酸50%为L型，50%为D型的CD色谱图
下面是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和异亮氨酸6个氨基酸对映体百分含量工作曲线，基本上是线性的。
图5-6 6个氨基酸对映体工作曲线
1.总氨基酸含量的测试
（1）测试步骤
①标准液的配制：准确称取50 mg每种待测的氨基酸标准品，转移至50 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀即可注射。
②样品液的配制：称取含有约50 mg以上任何一种氨基酸的样品，假如要测试多种氨基酸而每种含量不一样时，可调节称样量，使各氨基酸的浓度大致相同，或逐渐稀释来达到每种氨基酸的理想测试浓度。转入50 m L容量瓶中，加入30 mL水，振荡2 min，摇15 min，然后加水至刻度。摇匀后取少量溶液至5 m L离心管中，离心10 min，取上层清液即可注射。
（2）色谱条件
色谱柱：Acquity Hss T3 C18，1.8μm，2.1×150 mm
移动相A：10 mmol／L己烷基磺酸钠，p H 2.0
移动相B：乙腈
流速：0.40 mL／min
柱温：45℃
UV检测波长：210 nm
CD检测波长：220 nm
CD温度：35℃
注射量：2μL
梯度：
也可用分段方法：
如测甜菜碱的梯度：
测乙酰半胱氨酸、瓜氨酸和B-丙氨酰-L-组氨酸的梯度：
测蛋氨酸、谷胱甘肽、左旋肉碱、乙酰肉碱的梯度：
测乙酰肌酸、乙酰肌酐、精氨酸、甘氨酸、丙肉碱的梯度：
（3）结果计算
A标：标准品的峰面积
A样：样品的峰面积
V样：样品液的体积（mL）
C标：标样的浓度（mg／m L）
W 样：样品的质量（mg）
2.假如要定性和定量测试L／D型的百分比，就必须建立如图5-6所示的工作曲线。需要纯L和纯D 两种不同的氨基酸标准品，按不同比例配制溶液（如100%D型、90%D型……5%D型），但氨基酸的总量不变。根据样品溶液测得的CD面积与UV面积的比值，在工作曲线上可找到相对应的D%。
D型氨基酸量=氨基酸总量×D%
此方法仅适合于测试保健品中单个或多个游离的氨基酸，而复杂的氨基酸成分测试，如测试蛋白质中氨基酸的成分等，不能用此方法，要用柱前衍生法或离子色谱法来测试。
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2023-07-30
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