氨基酸都是极性的分子，很难保留在反相色谱柱上。所以只要将移动相的p H降低到3以下，除了天冬氨酸和谷氨酸，其他氨基酸都是带正电的。......
2023-07-02
氨基酸测试方法：柱前衍生求解
【摘要】：蛋白质或者肽水解而得的氨基酸种类多、含量大小差异大，再加上复杂的基质，使氨基酸的测试不能用直接的色谱方法。为了延长氨基酸的保留时间及提高测量灵敏度，就要用柱前衍生法来测试。有几种衍生剂可被用来与氨基酸反应生成衍生物。反应后产生的衍生物相对分子质量变大，极性变小，大大提高UV吸收灵敏度，这样就可以用色谱法来分离和定量测试各种不同氨基酸的衍生物。
蛋白质或者多肽水解后可以得到各种氨基酸。水解的方法很多，其中酸解的方法较为常用。本方法不涉及蛋白质或者肽的水解步骤。
蛋白质或者肽水解而得的氨基酸种类多、含量大小差异大，再加上复杂的基质，使氨基酸的测试不能用直接的色谱方法。为了延长氨基酸的保留时间及提高测量灵敏度，就要用柱前衍生法来测试。
有几种衍生剂可被用来与氨基酸反应生成衍生物。本方法用6-氨基喹啉基-N-琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）作为衍生剂。
反应后产生的衍生物（AQC-氨基酸）相对分子质量变大，极性变小，大大提高UV吸收灵敏度，这样就可以用色谱法来分离和定量测试各种不同氨基酸的衍生物。
反应后生成的衍生物碱性增强，在低p H 的移动相条件下，所有的AQC-氨基酸衍生物都成为阳离子，所以可以考虑用离子对的反相色谱方法来分离和定量测试各个AQC-氨基酸衍生物。参见第1章“移动相的应用”。
（1）测试步骤
①硼酸缓冲溶液配制：称取12.4 g硼酸，溶于400 mL水中，用40%的氢氧化钠溶液调节p H 至8.8，再加水至500 mL。
②AQC溶液的配制：称取10 mg AQC粉末，溶于10 m L乙腈，摇匀。
③标准液和样品液的配制：用0.15 mol／L盐酸来配制标准液和样品液，使每个氨基酸的浓度在1～5 mg／100 m L。
④衍生反应：分别移取20μL标准液、样品液和水至3个不同的200μL锥形注射瓶中，分别加入80μL硼酸缓冲液，振荡10 s，再分别加入20μL AQC溶液，振荡10 s，放入50℃的加热器中，10 min后取出，离心后即可注射。
（2）UPLC条件
色谱柱：Acquity UPLC®BEH Phenyl，1.7μm，2.1×150 mm
流速：0.4 mL／min
注射量：1.0μL
UV检测波长：248 nm
移动相A：10 mmol／L己烷基磺酸钠水溶液，p H 2.5
移动相B：甲醇
柱温：50℃
梯度：
（3）结果计算
A标：相应标准品的峰面积
A样：相应样品的峰面积
V标：标准液的总体积（m L）
V样：样品液的总体积（m L）
W 样：样品的质量（mg）
W 标：相应标准品的质量（mg）
总的氨基酸含量为各个测到的氨基酸含量的总和。
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2023-07-02
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