而番泻苷A和B等蒽醌类成分是其发挥药理作用的主要活性成分。测试步骤①标准液的配制：准确称取5 mg番泻苷A或番泻苷B标准品，转入100 mL容量瓶中，加入60 m L乙腈／水混合液，振荡至标准品全部溶解，再加入甲醇至刻度，摇匀后即可注射。②样品液的配制：称取一定量碾碎的含有约5 mg番泻苷A 或番泻苷B的样品，转入100 m L容量瓶中，加入60 m L 80℃的热水，振荡10 min，冷却后加入甲醇至刻度，摇匀，离心5 min，吸取清液即可注射。......
2023-07-02
欧洲越橘中花青素和花色苷的测试方法合集
【摘要】：欧洲越橘主要含有5类花青素以及它们的糖苷。反相色谱能把20来个欧洲越橘含有的花青素及花青素糖苷分离开，见图4-11。图4-11欧洲越橘的标准色谱图下面介绍2种测试方法：UV光谱法定量测试花青素及其糖苷、液相色谱定性及定量测试花青素及其糖苷。由于欧洲越橘价格要高于其他浆果，所以市场上有很多假货，用其他植物所含的花青素来代替欧洲越橘的花青素，所以必须用色谱方法得到一个完整色谱图才能确定花青素的来源。
欧洲越橘（bilberry）中含有花青素（anthocyanidins）及花色苷（anthocyanins），是高质量的还原剂，同时对改善视力（特别是夜盲症）也有帮助。欧洲越橘主要含有5类花青素（见下面的分子结构式）以及它们的糖苷。所有这些化合物都是p H 敏感化合物，改变p H 就会变色。
反相色谱能把20来个欧洲越橘含有的花青素及花青素糖苷分离开，见图4-11。
图4-11 欧洲越橘的标准色谱图（色谱图来自Indena Anthrocynines and Anthrocyindins test method）
下面介绍2种测试方法：UV光谱法定量测试花青素及其糖苷、液相色谱定性及定量测试花青素及其糖苷。
1.UV光谱法作定量测试［3］
（1）测试步骤
①p H 1.0的缓冲液配制：称取1.49 g氯化钾溶解于100 mL水中。另移取1.7 m L浓盐酸至100 m L容量瓶中，加水稀释至100 m L，摇匀。移取25 m L氯化钾溶液，加入67 m L盐酸，调节p H 至1.0。
②p H 4.5的缓冲液配制：将1.64 g醋酸钠溶解在100 mL水中，用盐酸把p H 调节至4.5。
③样品溶液的配制：称取75 mg 30%的欧洲越橘提取物，转入100 mL容量瓶中，加入80 mL水，超声15 min使其全部溶解，冷却后加水至刻度，摇匀。
④准确移取1 mL样品液至25 m L容量瓶中，加入p H 1.0缓冲液至刻度，摇匀。
⑤准确移取1 mL样品溶液至25 mL容量瓶中，加入p H 4.5缓冲液至刻度，摇匀。
若样品液浑浊，可离心取得澄清的溶液。
⑥将UV光谱仪用水归零。
⑦测量p H 1.0样品溶液的UV吸收值（在700 nm 和510 nm 处）；⑧测量p H 4.5样品溶液的UV吸收值（在700 nm 和510 nm 处）。
（2）计算结果
A：UV 吸收的差值=p H 1.0（UV吸收510nm-UV吸收700nm）-p H 4.5（UV吸收510nm-UV吸收700nm）
ε：1 mol／L花青素-3-葡萄糖苷的吸收差值（26 900）
M：花青素-3-葡萄糖苷的相对分子质量（449.2）
V：最终体积（100×25 mL）
L：UV经过样品液的长度（一般是1.0 cm）
W：样品的质量（mg）
2.用液相色谱来定性及定量测试花青素及其糖苷
UV的方法可以定量测试花青素及花青素苷的含量，但不能确定花青素来自哪种植物，具体的花青素组分是什么。由于欧洲越橘价格要高于其他浆果，所以市场上有很多假货，用其他植物所含的花青素来代替欧洲越橘的花青素，所以必须用色谱方法得到一个完整色谱图才能确定花青素的来源。如图4-11就是一个标准欧洲越橘的色谱图，与其他浆果完全不一样。只有显示上述色谱指纹的才是真的欧洲越橘。对色谱峰面积积分，并与已知量的标准品相比就能得到定量的结果。
（1）测试步骤
①标准溶液的配制：准确称取100 mg Indena的30%欧洲越橘提取物，转入50 mL容量瓶中，加入约30 mL含有1%盐酸的甲醇溶液，振荡或超声直到全部溶解，加入甲醇定容，摇匀后即可注射。如需要，可用甲醇稀释，直至合适的浓度。
②样品溶液的配制：称取相当于含有30 mg花青素的样品，转入50 mL容量瓶中。样品若是提取物，则按照上述标准溶液的配制步骤；样品若是原始的植物或干燥后的粉末，则按照如下步骤：将样品转入50 m L容量瓶中，加入40 m L含有1%盐酸的甲醇溶液，超声1 h，冷却后加入甲醇定容，摇匀，离心，取上层清液即可注射。若需要，可用甲醇稀释至合适的浓度。
（2）HPLC条件
色谱柱：Prodigy ODS（2），5μm，4.6×150 mm
移动相A：10%甲酸水溶液
移动相B：甲醇
流速：1.0 mL／min
柱温：室温
UV 检测波长：460 nm
注射量：10μL
梯度：
按照以上条件所得的色谱图可能与上面Indena色谱图不完全一样，但必须要与在同样条件下走出的标准品图像相一致，否则就不是欧洲越橘。
（3）结果计算
A标：标准品总的峰面积
A样：样品总的峰面积
V样：样品液的总体积（m L）
V标：标准液的总体积（m L）
W 样：样品的质量（mg）
W 标：标准品的质量（mg）
C标：标准品的纯度
标准品的纯度可按照上面的UV方法来测定。
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