测试银杏萜内酯的方法

2023-07-02 理论教育版权反馈

【摘要】：银杏叶或银杏叶提取物的主要有效成分有两大类，即银杏黄酮和银杏萜内酯。银杏黄酮的测试见上文，以下介绍银杏萜内酯的测试方法。这里用三甲基硅烷把银杏萜内酯和银杏半萜内酯分子中的羟基硅烷化，起到降低沸点的效果，然后注射进GC，使被测分子易汽化。

银杏叶或银杏叶提取物的主要有效成分有两大类，即银杏黄酮和银杏萜内酯（ginkgolactons）。银杏黄酮的测试见上文，以下介绍银杏萜内酯的测试方法。银杏萜内酯是总称，包括银杏萜内酯和银杏半萜内酯。

银杏萜内酯A　　R1=H，　　R2=H，　　R3=OH

银杏萜内酯B　R1=OH，　R2=H，　R3=OH

银杏萜内酯C　R1=OH，　R2=OH，　R3=OH

银杏萜内酯J　R1=H，　R2=OH，　R3=OH

银杏萜内酯M　R1=OH，　R2=OH，　R3=H

从以上分子结构可以看出银杏萜内酯和银杏半萜内酯只含有少数几个不共轭的双键，UV的吸收不强，没有特征性的吸收光谱，容易受干扰，而且含量很少，所以HPLC-UV方法不是最理想的方法。有的实验室用HPLC-ELSD的方法来测试银杏萜内酯和半萜内酯，只要ELSD检测器的线性得到验证，这种方法是可以选择的，以下介绍一个GC-FID的方法。

用GC来测试，就要降低化合物的沸点。这里用三甲基硅烷把银杏萜内酯和银杏半萜内酯分子中的羟基硅烷化，起到降低沸点的效果，然后注射进GC，使被测分子易汽化。

（1）测试步骤

●试剂

DHEA （dehydroisoandrosterone，internal standard），Sigma，D-4000 Bilobalide，95%，Sigma，S- 9031

银杏萜内酯A，90%，Sigma，G-4028

银杏萜内酯B，90%，Sigma，G-6910

银杏萜内酯C，98.5%，MP，199661

银杏萜内酯J，86.9%，ChromaDex，ASB-00007186

乙腈（ACN），HPLC Grade

N，N-二甲基甲酰胺（DMF），HPLC Grade

N，O-双（三甲基硅烷基）三氧乙酰胺（BSTFA）含1%三甲基氯硅烷（TMCS），reagent grade

●内标液的配制：准确称取15 mg DHEA，转移至25 mL容量瓶中，加入10 m L DMF来溶解，然后加入DMF至刻度。

●标准溶液的配制：准确称取10 mg银杏萜内酯A 和银杏半萜内酯，5 mg银杏萜内酯B、银杏萜内酯C、银杏萜内酯J，转移至10 mL容量瓶中，加入1 mL DMF，超声5 min，使所有标准品全部溶解，加入乙腈至刻度，摇匀。该标准品的原始液可以稳定6个月。

移取500μL标准原始液至2 mL注射瓶，加200μL内标液和200μL BSTFA（含1%TMCS）。盖紧后摇匀，放入100℃水浴中反应20 min。冷却至室温，等待注射。

●样品溶液的配制（银杏叶粉）：称取8.0 g银杏叶粉，转移至50 m L圆底回流瓶中，加入30 m L 30%的甲醇水溶液，回流15 min。把回流液转移至200 mL容器内，重复回流两次，合并回流液。用减压挥发器把回流液挥发干。用1 m L DMF超声水浴15 min来溶解挥发干后的残留物，移取全部1 mL DMF溶液至1 mL离心管内，离心（12 000 r／min）5 min。移取500μL上层清液至2 m L注射瓶内，加入200μL内标液、200μL BSTFA（含1%TMCS），盖紧瓶口，摇匀放入100℃水浴中反应20 min，冷却至室温，可直接注射。

样品溶液配制（银杏叶萃取物及含有萃取物的保健品）：称取500 mg萃取物或含有等量成分的保健品，转移至50 mL容量瓶中，加入3 mL DMF，超声15 min，每5 min摇30 s，加入27 m L乙腈，剧烈摇晃2 min，移取10 mL，离心5 min。取500μL上层清液至2 mL注射瓶内，加入200μL内标液、200μL BSTFA（含1%TMCS），放入100℃水浴中反应20 min，冷却至室温，可直接注射。

（2）GC操作条件

色谱柱：J&W 19091 J- 012 HP-5，0.318 mm×25 m，0.17μm

温度梯度：

FID检测器温度：300℃

注射室温度：250℃

（3）结果计算

C标：相应的银杏萜内酯标样的浓度（mg／mL）

W 样：样品的质量（mg）

A标：标准液中相应的银杏萜内酯的峰面积／标准液中内标的峰面积

A样：样品液中相应的银杏萜内酯的峰面积／样品液中内标的峰面积

V样：样品液的总体积（m L）

总银杏萜内酯的含量为各个测到的银杏萜内酯含量的总和。