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【摘要】：葡萄糖胺含有一个一级胺，很容易与异硫氰酸苯酯反应生成苯硫脲的衍生物。反应后产生的葡萄糖苯硫脲含有一个非极性的苯环，延长了色谱的保留时间，起到有效的分离效果。在色谱中衍生后的葡萄糖胺往往会出现两个峰，如图3-12所示，这可能是由于葡萄糖胺在溶液中有直链、环型、α和β不同构型共存而造成的。
葡萄糖胺（glucosamine）往往与硫酸软骨素和甲基磺酰基甲烷（MSM）组成关节类保健品。葡萄糖胺是极性化合物，在反相色谱中没有保留时间，也没有特征的紫外吸收波，所以用普通的HPLC-UV 无法测试。用IC-ED来测试葡萄糖胺是一个选择。这里介绍一个葡萄糖胺的柱前衍生测试法。葡萄糖胺含有一个一级胺，很容易与异硫氰酸苯酯（PITC）反应生成苯硫脲的衍生物。
反应后产生的葡萄糖苯硫脲含有一个非极性的苯环，延长了色谱的保留时间，起到有效的分离效果。另外，葡萄糖苯硫脲的紫外光谱显示在240 nm 处有一个最大吸收值，这样在240 nm 处可以得到非常高的检测灵敏度（＜0.1 ug／mL）。（1）测试步骤
①试剂
异硫氰酸苯酯（PITC Sigma P-4396）
D-葡萄糖胺盐酸的标准品（Sigma，G4875）
②溶液的配制
●5%PITC 甲醇溶液的配制：移取2.5 mL异硫氰酸苯酯至50 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀后待用。
●p H 8.3缓冲液的配制：称取5.22 g磷酸氢二钾，转移至100 mL容量瓶中，加入60 m L水，水浴超声至全部溶解，用磷酸调节p H 至8.3，加水至刻度，摇匀后待用。
●移动相A：0.1% 磷酸水溶液。
●移动相B：0.1% 磷酸甲醇溶液。
●标准品溶液的配制：准确称取50 mg葡萄糖胺标准品，转移至100 m L容量瓶中，加入约60 mL水，微波超声直至全部溶解，冷却后用水定容。再用水稀释5倍、25倍及125倍，摇匀，标上标签，待用。
●样品溶液的配制：称取一定量含有约50 mg硫酸软骨素的碾碎的样品，转移至100 mL容量瓶中，加入约60 m L水，微波超声20 min，冷却后用水定容，摇匀。取5 mL溶液至10 mL离心管中，离心5 min，取清液稀释10倍，摇匀待用。
③柱前衍生反应
分别准确移取1 mL各个浓度的标准溶液或样品溶液、1 mL p H为8.3的缓冲液及1 mL 5%的PITC甲醇溶液至各个不同的10 mL带有螺盖的试管中。用干净的盖子拧紧试管，然后在80℃的水浴中加热30 min，每隔5 min振荡1次。将试管移至冰水中冷却20 min，然后放入离心机离心5 min（3 000～5 000 r／min）。移取上层清液至2 mL注射瓶中，待注射。空白溶液可用水来代替标准溶液或者样品溶液进行衍生反应。
（2）色谱条件
色谱柱：Betasil C18，4.6×250 mm（Keystone Scientific P／N 255-701）或其他等效柱子
流速：1 mL／min
注射量：20μL
UV检测波长：240 nm
注射时间：30 min
柱温：室温
梯度：
注射3个不同浓度的标准液，作出一工作曲线，线性必须大于0.995。然后注射空白液，看有无干扰峰。最后注射样品溶液。
在色谱中衍生后的葡萄糖胺往往会出现两个峰，如图3-12所示，这可能是由于葡萄糖胺在溶液中有直链、环型、α和β不同构型共存而造成的。但这种结构的转换最终会达到动态的平衡，所以不管选用哪个峰来计算，最后的结果相同。如果用两个峰的总面积来计算最终也会得到同样的结果。
图3-12 葡萄糖胺的HPLC色谱图
（3）结果计算
C：从工作曲线上得到的样品溶液的浓度（mg／mL）
V：样品溶液的体积（m L）
W：样品的质量（mg）
D：样品溶液的稀释系数
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