保持圆筒垂直,使铜片不被水打湿,用经试样冲净的连接软管及其配件将装试样的容器与试验圆筒的A阀紧密连接。关闭A阀,勿使试验圆筒脱离试样容器。在试验圆筒已充满后,关闭阀A,卸开连接软管。立即把圆筒浸入40℃±0.1℃的恒温水浴中,让圆筒在水浴中放置1h。比较时应将铜片和标准腐蚀色板置于光反射约45°的方向上进行观察。......
2023-06-23
透明质酸测试方法：重点突出新透明质酸的简单易行测试方法
【摘要】：氨基葡萄糖和氨基半乳糖是手性异构体，所以透明质酸的双糖单体与无硫酸软骨素的双糖单体是对映体。透明质酸的测试方法与硫酸软骨素的相似，用选择性强的酶来酶解透明质酸，随后用色谱法来定量测试酶解产物的量，最后换算成透明质酸的含量。
透明质酸（hyaluronic acid）是一种不含硫酸根的聚多糖。
透明质酸的分子结构与无硫酸软骨素的分子结构相似，不同点是无硫酸软骨素的单元骨架结构是葡萄糖醛酸-氨基半乳糖，而透明质酸是葡萄糖醛酸-氨基葡萄糖。氨基葡萄糖和氨基半乳糖是手性异构体，所以透明质酸的双糖单体与无硫酸软骨素的双糖单体是对映体。
透明质酸的测试方法与硫酸软骨素的相似，用选择性强的酶来酶解透明质酸，随后用色谱法来定量测试酶解产物的量，最后换算成透明质酸的含量。
有两种酶可以分解透明质酸：一种是透明质酸酶，另一种是硫酸软骨素酶。SIGMA 提供的透明质酸酶的效果不好，而且对硫酸软骨素也有活性，可选用硫酸软骨素酶来分解透明质酸。酶解的过程和测试硫酸软骨素的方法完全一样，只是透明质酸的酶解产物除了不饱和双糖分子外还有不饱和四糖分子，所以色谱测试要包括双糖和四糖两者的含量。
（1）测试过程
①试剂
三羟甲基氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane］ Sigma货号：S-8750
四丁基铵（tetrabutylammonium hydrogen sulfate） Sigma货号：86853
浓盐酸（hydrochloride acid concentrated） ACS级
冰醋酸（acetic acid glacial） Sigma货号：320099
氯化钠（sodium chloride） ACS级
浓磷酸（phosphoric acid concentrated） LC级
无水醋酸钠（sodium acetate anhydrous） Sigma货号：S8705
α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid） Fluke货号：75890
硫酸软骨素二钠盐（chondroitin sulfate sodium） USP货号：1133570
磷酸氢二钾（potassium phosphate dibasic） 试剂级Sigma货号：P-8281
牛血清蛋白结晶（bovine serum albumin crystallized）＞97%Sigma货号：A4378
硫酸软骨素酶ACII（chondroitinase ACII） Sigma货号：E-2039
②溶液的配制
●移动相A的配制：称取340 mg四丁基铵，转移至1 000 mL容量瓶中，加入500 m L水溶解，后用磷酸和磷酸氢二钾调节p H 至3.5，摇匀，过滤待用。
注意：透明质酸不含硫酸根，仅在葡萄糖醛酸上有一个羧酸根。由于羧酸是弱酸，葡萄糖醛酸的p K a是3.2，如第1章1.2.2“离子对的应用”所述，为了让离子对有效工作，移动相的p H 要大于p K a+1。所以这里建议把移动相的p H调至4.5，这时由于离子对的作用力增强，要把移动相B的比例提高，才能得到理想的保留时间，起到更好的分离效果。
●移动相B：乙腈。
●0.13 mol／L 盐酸的配制：在100 mL容量瓶中加入50 m L水，准确移取1.1 mL浓盐酸，转移至容量瓶中，摇匀，再加水至刻度，摇匀。
●酶解营养液的配制：用100 m L 0.13 mol／L盐酸溶解3 g三羟甲基氨基甲烷、2.4 g醋酸钠、1.46 g氯化钠和50 mg牛血清蛋白结晶，用盐酸和氢氧化钾溶液调节p H 至8.0。
●硫酸软骨素酶溶液的配制：用1 mL 水溶解10单位的硫酸软骨素酶ACII，不用时可保存在温度低于0℃的冰箱中。
●标准品溶液的配制：准确称取200 mg透明质酸标准品，转移至50 mL容量瓶中，加入约30 m L水，微波超声直至全部溶解，冷却后用水定容，摇匀待用。
●样品溶液的配制：称取一定量的碾碎的含有约400 mg透明质酸的固体或液体样品，转移至100 mL容量瓶中，加入约60 m L水，微波超声20 min，冷却后用水定容，摇匀。取5 m L溶液至10 m L离心管中，离心5 min。取清液待用。
③标准溶液及样品溶液的酶解过程：精确移取20μL酶解营养液至各个200μL锥形注射瓶中，分别加入20μL标准品溶液或20μL样品溶液或20μL水（作空白样品）到上述锥形注射瓶中，最后在每个锥形注射瓶中再加入20μL硫酸软骨素酶溶液，振荡摇匀，放入37℃烘箱中，酶解3 h后取出，冷却。移取锥形注射瓶内的全部溶液至一个2 mL注射瓶中，精确移取100μL水清洗200μL锥形注射瓶，移取所有洗液至2 mL注射瓶中，重复1次。这时注射瓶中已有260μL液体，最后再加740μL移动相A至每个注射瓶中，这样每个注射瓶中溶液的总体积为1 mL，振荡摇匀后即可注射。
（2）UPLC条件
色谱柱：Acquity UPLC®BEH C18，1.7μm，2.1×150 mm
柱温：45℃
流速：0.45 mL／min
UV检测波长：232 nm
移动相：93%移动相A，7%移动相B
注射量：3μL
测试时间：10 min
先重复注射标准品溶液3次，检查系统的适应性。3次注射的峰面积和保留时间的%RSD 必须小于2。然后可继续注射标准品溶液、空白溶液和样品溶液，直至结束。结束前最好再注射标准品溶液1次，和起初注射的结果相比较，确认系统的稳定性，见图3-11。
（3）计算方法
C标：标准溶液的浓度（mg／mL）
V样：样品溶液的体积（m L）
W 样：样品的质量（mg）
图3-11 水解后透明质酸的色谱图：HA1是酶解后产生的不饱和双糖，HA2是酶解后产生的不饱和四糖
由于反相色谱无法分离酶解后产生的无硫酸软骨素和透明质酸的不饱和双糖，所以假如样品中含有硫酸软骨素，可以用硫酸软骨素的色谱条件来走一下，按照一般的规律，无硫酸软骨素的峰面积大概是其他硫酸软骨素总的峰面积的5%，然后从样品液中总的峰面积里减去来自无硫酸软骨素的面积，即可以算出透明质酸的含量。
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