硫酸软骨素（chondroitin sulfate）是动物结缔组织的主要成分，常与氨基葡萄糖和甲基磺胺甲烷一起组成维护关节功能的保健品。
保健品中的硫酸软骨素一般是从动物软骨中提取出来的游离态的硫酸软骨素，但是也有一些保健品、功能性食品、宠物饲料等是直接用动物的软骨来作为原料。要测试软骨中的硫酸软骨素，首先要把硫酸软骨素从软骨中水解出来。本方法最后一节介绍了这个水解的方法。
硫酸软骨素是含有硫酸根的双糖聚合体，平均相对分子质量在20 000～50 000。每个双糖单体是由一个葡萄糖醛酸和一个半乳糖乙酰胺组成的骨架，其分子结构如下所示。
由于硫酸软骨素的相对分子质量分布很广，和其他的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的结构相近，没有特征及高灵敏度UV 吸收，再加上分子的强极性，所以对它的测试很有挑战性。目前工业界流行的一些方法缺少选择性，无法区别硫酸软骨素和其他的GAG及一些廉价替代品，举例如下：
●Carbazole方法。根据Carbazole能和硫酸软骨素水解后产生的己糖反应生成红色的化合物，用比色法可测出己糖的含量，然后换算成硫酸软骨素的含量。但Carbazole方法无法区别硫酸软骨素和其他的GAG，以及含有己糖的其他化合物，甚至己糖本身。一些掺假的硫酸软骨素很容易通过这个测试。
●十六烷基吡啶滴定法。该方法被工业界广泛用来测试硫酸软骨素。但是十六烷基吡啶不仅可以和硫酸软骨素作用形成沉淀，还可与任何相对分子质量足够大的阴离子起反应形成沉淀，包括含有阴离子的GAG、一些表面活性剂，甚至一些大分子的无机阴离子。很多伪劣和假冒产品能出现在市场上，都是由于这个测试方法的局限性引起的。
●反相HPLC的方法。硫酸软骨素是强极性的化合物，在反相色谱柱中没有作用力，保留时间很短，很难与其他极性化合物分离。而且硫酸软骨素本身是没有特征UV吸收的，很难从UV光谱来识别硫酸软骨素分子。
●分子筛的色谱方法。该方法只能鉴别分子的大小，对分子的结构、极性等根本无法鉴定，所以无法区别硫酸软骨素和其他聚合物。
以下介绍一个特征性和选择性很强的方法，即酶解后的液相色谱方法［1］。
硫酸软骨素酶ACII和硫酸软骨素酶ABC能高选择性地酶解硫酸软骨素和透明质酸（hyaluronic acid），但对其他GAG和聚多糖则不起作用。
硫酸软骨素主要有以下几个组分：硫酸软骨素A、C、D、E，三硫酸软骨素以及无硫酸软骨素，这些组分的差别就在于硫酸根的数目和位置的不同。
硫酸软骨素B不属于硫酸软骨素，因为它有不同的功能。硫酸软骨素B还有一个比较通用的名字，叫硫酸皮肤素（dermatan sulfate）。硫酸软骨素A 和硫酸软骨素B是立体异构体，酶解后产生的不饱和双糖也是立体异构体，液相色谱是无法分离的。
为了在最后结果中排除硫酸软骨素B，本方法选用了硫酸软骨素酶ACII。硫酸软骨素酶ACII只能酶解硫酸软骨素A、C、D、E及无硫酸软骨素、三硫酸软骨素和透明质酸，对硫酸软骨素B不起作用。
硫酸软骨素A、C、D、E，三硫酸软骨素和无硫酸软骨素经硫酸软骨素酶ACII酶解后会产生相应的不饱和双糖，见图3- 5。
酶解后的双糖含有一个双键并与原来的羧酸酸根上的双键形成共轭，所以酶解后的不饱和双糖在232 nm 有一个特征的UV 吸收峰，而且有一定的灵敏度。用反相色谱加离子对的方法可以把酶解出来的各种不同的不饱和双糖分离开，并可定量测试出双糖的含量，从而换算出硫酸软骨素的总含量。
硫酸软骨素酶解后产生相应的不饱和双糖，ΔDi-0S来自无硫酸软骨素；ΔDi-4S来自硫酸软骨素A；ΔDi-6S来自硫酸软骨素C；ΔDi-2，6diS来自硫酸软骨素D；ΔDi-4，6diS来自硫酸软骨素E；ΔDi-2，4，6triS来自三硫酸软骨素。
图3-5 硫酸软骨素酶解后生成了相应的不饱和双糖
（1）测试过程
①试剂
三羟甲基氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane］ Sigma货号：S-8750
四丁基铵（tetrabutylammonium hydrogen sulfate） Sigma货号：86853
浓盐酸（hydrochloride acid concentrated） ACS级
冰醋酸（acetic acid glacial） Sigma货号：320099
氯化钠（sodium chloride） ACS级
浓磷酸（phosphoric acid concentrated） LC级
无水醋酸钠（sodium acetate anhydrous） Sigma货号S8705
α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid） Fluke货号：75890
硫酸软骨素二钠盐（chondroitin sulfate sodium） USP货号：1133570
磷酸氢二钾（potassium phosphate dibasic） 试剂级Sigma货号：P-8281
牛血清蛋白结晶（bovine serum albumin crystallized） ＞97% Sigma货号：A4378
硫酸软骨素酶ACII（chondroitinase ACII） Sigma货号：E-2039
②溶液的配制
●移动相A的配制：称取340 mg四丁基铵，转移至1 000 m L容量瓶中，加入500 mL水溶解后用磷酸和磷酸氢二钾调节p H 至3.5。摇匀，过滤待用。
●移动相B：乙腈。
●0.13 mol／L盐酸的配制：在100 m L容量瓶中加入50 mL水，准确移取1.1 mL浓盐酸至容量瓶中，摇匀，再加水至刻度，摇匀。
●酶解营养液的配制：用100 mL 0.13 mol／L盐酸溶解3 g三羟甲基氨基甲烷、2.4 g醋酸钠、1.46 g氯化钠和50 mg牛血清蛋白结晶，用盐酸和氢氧化钾溶液调节p H 至8.0。
●硫酸软骨素酶溶液的配制：用1 mL水溶解10单位的硫酸软骨素酶ACII，不用时可保存在低于0℃的冰箱中。
●标准品溶液的配制：准确称取200 mg硫酸软骨素USP标准品，转移至50 m L容量瓶中，加入约30 mL水，微波超声直至全部溶解，冷却后用水定容，摇匀待用。
●内标溶液的配制：准确称取50 mgα-酮戊二酸，转移至25 mL容量瓶中，加入约15 m L水，微波超声直至全部溶解，冷却后加水至刻度，摇匀，待用。
●样品溶液的配制：称取一定量碾碎后的含有约400 mg硫酸软骨素的固体样品或液体样品，转移至100 mL容量瓶中，加入约60 mL水，微波超声20 min，冷却后用水定容，摇匀。取5 mL溶液至10 mL离心管中，离心5 min。取清液待用。
③标准溶液及样品溶液的酶解过程
精确移取20μL酶解营养液至各个200μL锥形注射瓶中，分别加入20μL标准品溶液，或20μL样品溶液，或20μL水（作空白样品）至上述小瓶中，最后在每个小瓶中再加入20μL硫酸软骨素酶溶液，振荡摇匀，放入37℃恒温箱中，酶解3 h后取出，冷却。移取小瓶内的全部溶液至一个2 mL注射瓶中，精确移取100μL水清洗200μL的小瓶，移取所有洗液至2 mL注射瓶中，重复1次。这时注射瓶中已有260μL液体。再精确移取100μL内标溶液至注射瓶中，最后再加640μL移动相A至每个注射瓶中，这样每个注射瓶中溶液的总体积为1 mL，振荡摇匀后即可注射。样品溶液不一定要加内标溶液，最后加740 mL移动相A即可。
（2）色谱条件
①HPLC条件
色谱柱：Phenomenex Prodigy，5μm，4.6×250 mm
柱温：室温
流速：1.0 mL／min
UV检测波长：232 nm
移动相：88%移动相A，12%移动相B
注射量：10μL
测试时间：30 min
先重复注射标准品溶液3次，检查系统的适应性。3次注射的峰面积和保留时间的%RSD 必须小于2。然后可继续注射标准品溶液、空白溶液和样品溶液，直至结束。结束前最好再注射标准品溶液1次，和起初注射结果相比较，确认系统的稳定性，见图3- 6、图3- 7。
图3-6 HPLC色谱图：标准品溶液含内标（α-酮戊二酸）
图3-7 HPLC色谱图：标准品溶液不含内标（α-酮戊二酸）
②UPLC条件
色谱柱：Waters Acquity Hss T3（C18），1.8μm，2.1×150 mm
柱温：45℃
流速：0.4 mL／min
UV检测波长：232 nm
移动相：85%移动相A，15%移动相B
注射量：2μL
测试时间：8 min
先重复注射标准品溶液3次，检查系统的适应性。3次注射的峰面积和保留时间的%RSD 必须小于2。然后可继续注射标准品溶液、空白样品溶液和样品溶液，直至结束。结束前最好再注射标准品溶液一次，和起初注射的标准液结果相比较，确认系统的稳定性，见图3- 8、图3- 9。
图3-8 UPLC色谱图：标准品溶液含内标（α-酮戊二酸）
来自陆地动物的硫酸软骨素主要含有硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和无硫酸软骨素三种，而且硫酸软骨素A的含量大于硫酸软骨素C。目前美国药典（USP）的测试方法仅限于陆地动物的硫酸软骨素。
其实海洋动物也含有高质量的硫酸软骨素，比如鲨鱼软骨中就含有高含量的硫酸软骨素，市场上也有很多海洋动物的硫酸软骨素保健品。海洋动物的硫酸软骨素不仅含有硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和无硫酸软骨素，还有硫酸软骨素D、硫酸软骨素E和三硫酸软骨素。与陆地动物的硫酸软骨素不同，海洋动物的硫酸软骨素C的含量大于硫酸软骨素A。所以依照硫酸软骨素A 和硫酸软骨素C的比例，可以预测是陆地还是海洋动物的硫酸软骨素，或是陆地和海洋的混合物。
图3-9 UPLC色谱图：标准品溶液不含内标（α-酮戊二酸）
一般来说，如色谱图中硫酸软骨素A 和硫酸软骨素C的峰面积之比小于1.5，样品中可能含有海洋动物的硫酸软骨素。这时就必须改变色谱条件（如下），让硫酸软骨素E、硫酸软骨素D和三硫酸软骨素也能被依次洗脱出来，然后用硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E，无硫酸软骨素和三硫酸软骨素总的峰面积来计算最终结果，如图3- 10所示。
图3-10 海产类硫酸软骨素的UPLC色谱图
UPLC条件
色谱柱：Waters Acquity Hss T3（C18），1.7μm，2.1×150 mm
柱温：45℃
流速：0.4 mL／min
UV检测波长：232 nm
注射量：2μL
测试时间：15 min
梯度：
（3）计算方法
A样：样品总的峰面积
A标：标准品总的峰面积
V样：样品溶液的总体积（mL）
W 样：样品的质量（mg）
C标：标准溶液的浓度（mg／m L）
为了确认酶的活性，首先要计算酶解后总的不饱和双糖的峰的响应因子要大于内标峰的响应因子1.5倍，即
如果这个比例小于1.5，那意味着有可能酶解不完全，或者酶的活性有问题。如果酶的活性太低，那么测出的结果可能会有偏差，尽管样品和标准样用的是相同的酶，酶解条件也相同。从动物软骨中提取硫酸软骨素的步骤如下：称取约5 g粉碎的软骨，浸泡在40℃的1.75%氢氧化钠水溶液中，每0.5 h摇动一次，共浸泡3 h。冷却后用1∶3的盐酸把p H 调节至8.5。加1 g胰酶，放入45℃的水浴中酶解，每0.5 h摇动一次，4 h后结束酶解。过滤后，取清液，按前述步骤来测试游离硫酸软骨素。
②样品液的配制：称取约含有10 mg总柑橘生物类黄酮的样品，转入100 mL容量瓶中，加入30 m L二甲基亚砜／甲醇混合液，超声10 min（提取物）或40 min（原草），冷却后加入甲醇至刻度，摇匀，离心后即可注射。UPLC条件色谱柱：Acquity HSS T3 C18，100×2.1 mm流速：0.5 mL／min注射量：2μLUV检测波长：280 nm移动相A：0.1% 磷酸水溶液移动相B：乙腈梯度：图4-14柑橘生物类黄酮的UPLC色谱图结果计算甲基橙皮苷、圣草酚、橙皮素、红橘素、川皮苷的计算公式同上。......
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