LC-MS／MS检测器可满足这方面的测试要求。测试步骤①标准液的配制：分别称取20 mg维生素D2、维生素D3和维生素K1标准品，转移至100 mL容量瓶中，加入约60 mL乙醇，待所有的标准品溶解后，加入乙醇至刻度，摇匀待用。再进一步稀释5倍、25倍和125倍，得到大约200 ppb、40 ppb和8 ppb的维生素D2、维生素D3、维生素K1，以及100 ppb、20 ppb和4 ppb的维生素K2标准溶液。......
2023-07-02
维生素B12和生物素的LC-MS/MS测试方法
【摘要】：通常在保健品的配方中维生素B12、生物素和叶酸的含量都是微克级，在样品准备过程中为了有效萃取待测化合物，降低干扰成分，通常最后的浓度是ppb级的，一般用LC／UV 比较难检测，所以建议用LCMS／MS来测试。现代的MS／MS检测极限对以上3个化合物都能达到ppb级。生物素：维生素B12：图2-4为维生素B12和生物素的LC-MS／MS的色谱图。图2-4维生素B12（上）和生物素（下）的TIC色谱图结果计算按第1章“LC-MS／MS的定性及定量测试”步骤来进行。
通常在保健品的配方中维生素B12、生物素和叶酸的含量都是微克级，在样品准备过程中为了有效萃取待测化合物，降低干扰成分，通常最后的浓度是ppb级的，一般用LC／UV 比较难检测，所以建议用LCMS／MS来测试。现代的MS／MS检测极限对以上3个化合物都能达到ppb级。
（1）测试步骤
①标准溶液的配制见P34，继续稀释到如表2的浓度。
表2 配制3个不同浓度的标准溶液（浓度：ppb）
不同的仪器有不同的灵敏度，以上标样的浓度可根据实验室的具体情况来调节。
首先注射3个不同浓度的标准溶液，建立工作曲线，工作曲线的R 2应该大于0.995。
②样品溶液的配制：见P34-35，浓度调到与标准液相似。
样品添加液的配制：假如测得的样品溶液的浓度是50 ppb，那么取995μL样品溶液，加入5μL 10 ppm 浓度的标准溶液，摇匀后即可注射。
计算回收率：
C样：测得的样品溶液的浓度
C加：测得的添加了标准品的样品溶液的浓度
C理论：加入标准品后的样品溶液的理论浓度
如上面的例子：加入标准品后的样品溶液的理论浓度=50×0.995+10 000×0.005=99.75 ppb
假如测出的C加是95 ppb，那么回收率为：
但假如回收率太低（如＜80%），那就不能简单地用回收率去调整已测出的样品结果，因为这时仪器的线性可能是有问题的。这时就要按照第1章“LCMS／MS的定性及定量测试”的方法来处理。
（2）色谱条件及MS／MS参数
①UPLC条件
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS Ts C18，1.8μm，2.1×150 mm
注射量：1μL
流动相A：0.1% 甲酸水溶液
流动相B：0.1% 甲酸乙腈溶液
流速：0.4 mL／min
柱温：45℃
梯度：
（续表）
②MS／MS参数：
为了准确地确认被测分子，每个母离子选了3个离子对。
生物素：
母离子的m／z（母离子的质量／电介数）是245.13
离子对一：245.13＞97.06
离子对二：245.13＞123.01
离子对三：245.13＞166.38
生物素的色谱峰必须含有这3个离子对，而且这3个离子对的峰面积之比要和标准品一致。作为定量计算，可用3个离子对之总和（total ion count，TIC）或浓度最大的一对离子对来计算。
维生素B12：
母离子的m／z 是678.52（1 357.04／2）
离子对一：678.52＞147.25
离子对二：678.52＞359.25
离子对三：678.52＞456.91
离子对的选择取决于仪器，不同的仪器选择的离子对可能不一样。下面的MS／MS参数是来自Waters的UPLC-MS／MS TQS仪器。
生物素：
维生素B12：
图2-4为维生素B12和生物素的LC-MS／MS的色谱图。
图2-4 维生素B12（上）和生物素（下）的TIC色谱图
（3）结果计算
按第1章“LC-MS／MS的定性及定量测试”步骤来进行。
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2023-07-02
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2023-07-02
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2023-07-02
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2023-07-02
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