PCNA基SERS基板：一种多功能分子检测方法

2023-06-30 理论教育版权反馈

【摘要】：为了证明PCNA作为SERS底物的高吸附性和可重复性，在PCNA基板上对R6G进行了SERS测试。与其他基板相比，PCNA具有最高的拉曼信号增强，表明其相对最高的吸附性，这是由其多孔纳米线形态和碳基材料本身特性引起的。此外，为了评估PCNA基板的复现性，对20个不同的PCNA基板进行了测量重现性测试。随后将积分时间减少到1 s，将Mf减少到0.4%，获得了在PCNA基板上具有类似拉曼信号强度的β-乳球蛋白分子的拉曼光谱。

1.R6G分子

图2.18　PCNA基板上的R6G的SERS

（a）硅片、PNA、CNA和PCNA基板上浓度为10 μmol ·L-1的R6G分子在30 s的积分时间下测得的拉曼光谱（激光功率为1 mW），PCNA由于其多孔的形态和碳基结构而具有出色的吸附性；（b）在1 mW的激发功率下，在30 s的积分时间内吸附在PCNA基板上的不同浓度的R6G分子的拉曼光谱测量值；（c）在 1 185 cm-1、1 309 cm-1、1 361 cm-1、1 507 cm-1和1 650 cm-1处不同浓度的拉曼峰强度（PCNA底物对R6G 分子的检测极限约为10 nmol ·L-1）；（d）在不同PCNA底物上的R6G分子的SERS重现性测量（选取了20个底物测试，1 185 cm-1、1 309 cm-1、1 361 cm-1、1 507 cm-1和1650 cm-1处拉曼峰的相对强度差异为±10%）

PCNA基板上的R6G的SERS如图2.18所示。为了证明PCNA作为SERS底物的高吸附性和可重复性，在PCNA基板上对R6G进行了（一种高度荧光的若丹明家族染料）SERS测试。为了进行比较，获得了相同条件下（都使用R6G分子的10 μmol ·L-1去离子水溶液，积分时间均为30 s）在硅、PNA、CNA和PCNA衬底上吸附R6G分子的拉曼光谱，其中使用的激光波长为785 nm，功率为10 mW，如图2.18（a）所示。与其他基板相比，PCNA具有最高的拉曼信号增强，表明其相对最高的吸附性，这是由其多孔纳米线形态和碳基材料本身特性引起的。此外，为了评估PCNA底物的高敏感性，我们进而测试了PCNA底物上浓度依次降低的R6G分子的SERS光谱（图2.18（b））。从图中可以明显看出，R6G分子的PCNA底物的检出极限约为10 nmol ·L-1，这对常规金属底物而言是很难实现的，因为此时R6G分子的强荧光会掩盖更弱的拉曼信号。要注意的是，碳基材料的使用有效淬灭了R6G分子的荧光，表明PCNA底物能够分析大部分具有荧光特性的生物分子。如图2.18（c）所示，PCNA基质在1 185 cm-1、1 309 cm-1、1 361 cm-1、1 507 cm-1和1 650 cm-1处的R6G浓度与信号强度之间也呈现出良好的单调递增关系。此外，为了评估PCNA基板的复现性，对20个不同的PCNA基板进行了测量重现性测试。如图2.18（d）所示，所有20个底物在 1 185 cm-1、1 309 cm-1、1 361 cm-1、1 507 cm-1和1 650 cm-1处拉曼峰的相对强度的标准偏差仅为5.686，表明PCNA具有高可靠性，能够反复使用。

此处需要说明的是，R6G拉曼峰强度的计算方法如下：选择基线校正方法以最小化荧光对拉曼光谱的影响。此外，使用785 nm波长的激光作为激发光，以最小化R6G的荧光，在此基础上测量了峰强度与基线的相对高度。所有上述20个底物在1 185 cm-1、1 309 cm-1、1 361 cm-1、1 507 cm-1和1 650 cm-1处拉曼峰的相对强度的差异具有的标准偏差（SD），如式（2.5）所示：

式中，xi是每个拉曼峰的相对强度，x是在一定拉曼位移下20个样品的平均峰强度。经过计算，发现1 361 cm-1峰强度的标准偏差SD1361是5.647、SD1185是5.537、SD1309是5.593、SD1507是5.540、SD1650是5.559，此外所有峰强度的SD为5.686。

2.β-乳球蛋白分子

接下来，为了证明PCNA基板对生物分子具有高灵敏度检测能力，我们在PCNA基板上进行了β-乳球蛋白（牛奶和羊奶的主要乳清蛋白）的SERS研究。使用波长为785 nm、功率为2 mW的激发光（积分时间为300 s），测量了在硅基板上质量分数（Mf）为100%的β-乳球蛋白粉末的拉曼光谱（图2.19（a））。随后将积分时间减少到1 s，将Mf减少到0.4%，获得了在PCNA基板上具有类似拉曼信号强度的β-乳球蛋白分子的拉曼光谱。通过计算发现，β-乳球蛋白在PCNA基板上的增强因子为（300 s/1 s）×（100%/0.4%）×（30 000/2 000）=约106。要注意，PCNA底物上的β-乳球蛋白分子的每一个特征拉曼峰都可以被很好地区分并且与其真实情况一致，这表明，PCNA底物具有很高的生物相容性。为了进行比较，还获得了相同条件下在硅基板和商业金属SERS基板（银金混合基板）上的β-乳球蛋白分子的拉曼光谱，如图2.19（a）所示。在硅基板上，由于不存在SERS增强，没有可见的特征拉曼峰，而在金属衬底上，拉曼光谱得到了增强，但比PCNA衬底弱了10倍。同样，金属基板上的β-乳球蛋白分子的特征拉曼峰与从硅基底上获得的峰不符（图2.19（a））。最后，为了评估PCNA基板在拉曼信号强度上的点对点一致性，在β-乳球蛋白分子的两个特征拉曼峰（999 cm-1和1 447 cm-1）上对PCNA基底上的β-乳球蛋白的特征拉曼峰进行对比，无论拉曼峰的强度还是形状（图2.19（b）），PCNA基板的平均变异系数（CV）均小于7.8%，远小于传统金属基板的变异系数。这些结果很好地说明了PCNA基板是很可靠的能示踪痕量蛋白质（通常容易受热）的极佳平台。

图2.19　β-乳球蛋白在PCNA底物上的SERS

（a）在硅片、PCNA和商业金属基材上测得的β-乳球蛋白分子的拉曼光谱（在PCNA基板上，β-乳球蛋白分子的拉曼信号强度比在金属基板上高10倍）；（b）PCNA底物上的β-乳球蛋白的 SERS图谱显示在分子的两个特征拉曼位移上（999 cm-1和1 447 cm-1），拉曼增强因子具有高表面均一性（步阶分别为1 μm和0.1 μm）；（c）增强因子在大、小尺度上的直方图

3.葡萄糖分子

为了证明PCNA底物在增强因子中不同样品间的一致性，我们还对葡萄糖分子进行了SERS检测（一种用于检测糖尿病的著名生物标记物）。需要指出的是，葡萄糖分子对于无畸变SERS检测而言是具有挑战性的分子。图2.20（a）显示了在785 nm的光激发下，硅和PCNA基板上葡萄糖分子在使用去离子水作为溶液的拉曼光谱，其中硅用作对比研究。在PCNA底物上，即使在0.1%的低Mf值下（对应于5.6 mmol ·L-1的浓度，与人体血液中3～7 mmol ·L-1的葡萄糖浓度一致），葡萄糖分子的所有特征拉曼峰也能被清晰地识别和区分。比较硅和PCNA基板上的拉曼光谱可得到（300 s/ 1 s）×（100%/0.4%）×（12 000/2 000）=约106的增强因子，与β-乳球蛋白的增强因子的测量结果一致。重要的是，即使这种在极低浓度下获得的拉曼信号，葡萄糖分子特征拉曼峰的位置也与其真实情况相吻合（而每个拉曼峰都有不同的化学增强），这归因于高生物相容性和光热稳定性PCNA基板的强大能力。此外，为了显示PCNA底物的时间一致性，每小时在相同条件下进行葡萄糖的SERS测量。如图2.20（b）所示，葡萄糖分子的拉曼光谱在时间上是稳定的，进而证明了PCNA基板的高可靠性。

图2.20　葡萄糖在PCNA基底上的SERS

（a）在硅和PCNA基底上的葡萄糖分子的拉曼光谱；（b）PCNA基质在拉曼光谱中的时间一致性（在拉曼光谱中存在每小时可忽略不计的波动，显示出高再现性和生物相容性）

4.R6G、β-乳球蛋白和葡萄糖的拉曼峰分配

先前已经介绍R6G光谱特征的详细分配，这与前面所描述的结果高度一致，总结如表2.3所示。在1 000 cm-1～1 700 cm-1范围内，由于碳骨架的拉伸模式，很明显这种拉伸模式下产生了最强的R-R带。此外，R6G的C—C拉伸模式会在拉曼光谱的1 185 cm-1、1 309 cm-1、1 361 cm-1、1 507 cm-1、1 575 cm-1和1 650 cm-1处产生强吸收峰。

表2.3　R6G、β-乳球蛋白和葡萄糖的拉曼光谱中主要峰的分配

a±5 cm-1bPhe（苯丙氨酸）
cTrp（色氨酸）

对于β-乳球蛋白，拉曼峰在1 001 cm-1处是由于苯丙氨酸（Phe）的C—C环拉伸振动所致，该振动通常与其他谱带分开，并且其强度不受蛋白质构象变化的影响。在1 245 cm-1处的拉曼峰是酰胺Ⅲ型区，主要由肽键的C—N拉伸和N—H面内弯曲振动产生。β-乳球蛋白C—H的弯曲和摆动模式出现在1 376 cm-1和1 454 cm-1处。1 547 cm-1处产生的拉曼峰可归因于二硫键构象以及氨基酸残基周围微环境的变化。

对于葡萄糖，836 cm-1处的拉曼峰可以指定为C—C的拉伸模式。924 cm-1处的拉曼峰可以指定为C—H的弯曲模式。1 028 cm-1处的拉曼峰可以指定为C—O的拉伸模式。1 255 cm-1处的拉曼峰可以指定为—CH2的扭曲模式。拉曼峰在1 350 cm-1处可以指定为—CH2的摆动模式。另外，还可以将1 403 cm-1和1 480 cm-1处的拉曼峰分配给—CH2的弯曲模式。

PCNA基SERS基板：一种多功能分子检测方法

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