t-PA的分离纯化与质量监控方案优化

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：另一方面，设计的纯化工艺包括特定的层析步骤及层析的先后顺序，以期得到最大的得率。

（一）动物细胞产品的分离纯化方法

下游的分离纯化步骤要在可替换的分离技术间进行选择。例如：细胞的破碎可选择高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎或酶溶法；分离细胞、细胞碎片、包含体或沉淀物，可选择离心或过滤；需要进行浓缩的时候，可选择沉淀或超滤。另一方面，设计的纯化工艺包括特定的层析步骤及层析的先后顺序，以期得到最大的得率。吸附层析，如离子交换层析、疏水层析和亲和层析，可基于特定的选择性达到对目标蛋白的纯化，适用于大量样品的处理。凝胶过滤层析用于后续的精制步骤，如去除少量的杂蛋白或聚合体，在纯化过程中用于脱盐和缓冲液交换。

在分离纯化中对每个步骤的选择，可以遵循以下原则：①应尽可能地利用蛋白质的不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同的技术进行多次纯化；②不同的蛋白质在性质上有很大的不同，这是能从复杂的混合物中纯化出目标蛋白的依据，每一步纯化步骤应当充分利用目标蛋白和杂质成分物理性质的差异，所以在分离纯化的开始阶段，要尽可能了解目标蛋白的特性，以及所存在杂质成分的性质；③在纯化的早期阶段要尽量减少处理的体积，方便后续的纯化；④在纯化的后期阶段，再使用造价高的纯化方法，这是因为处理的量和杂质的量都已减少，有利于昂贵纯化材料的重复使用，减少再生的复杂性。

工程细胞表达的产物经常和细胞内容物、培养基成分等混杂在一起，这些物质与目标产物的理化性质非常相近；产品多用于人体，为防止杂质对人体的有害作用，要求纯度很高；大多数动物细胞产物产量低，生物活性不稳定，需要非常温和、精细的分离纯化条件，包括分离时的pH、温度和盐离子浓度等；每种细胞产品的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不相同。因此，工程细胞表达的产物分离费钱费时。工程细胞表达的产物一般分泌在细胞外，以具有生物活性的形式出现在培养上清液中。可以利用的分离方法有离心、超滤、盐析、透析、凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析以及HPLC等。

1.查资料，讨论蛋白质分离纯化方法的种类、原理和操作过程。

2.讨论t-PA分离纯化的方法及实验过程。

3.确定需要哪些仪器设备及药品。

4.小组成员分工分离t-PA。

（二）动物细胞产品的质量控制

动物细胞产品的质量控制应当从动物细胞本身、生产工艺以及产品质量的要求几个方面来控制。

（1）动物细胞的要求　①对于动物细胞，必须有该细胞系的详细历史资料，包括来源、动物的年龄和性别（如果来源于人，还必须包括该人的病史）、细胞分离的方法和所用的培养材料等；②有该细胞特性的资料，包括生长形态、特性，种源特性以及特异的染色体标记；③无任何细菌、支原体和病毒污染，以及其他任何外来有害因子的污染。

（2）生产工艺的要求　①生产厂房必须符合国家规定的GMP要求，一切原材料、试剂都必须经过质量检定、可靠，尽可能确定固定的生产厂家，尽可能使用卫生部门批准的允许用于生产或临床使用的材料；②细胞培养过程中尽可能少用或不用小牛血清，必须用时要严格挑选以防病毒和支原体污染；③配制培养基时必须使用无热原、无离子超纯水；④培养过程中必须详细记录细胞各种数据，包括接种量、细胞密度、产量表达量等；⑤纯化过程中操作环境尽可能保证4℃左右，所用器材必须经过无菌和无热原处理；⑥纯化步骤尽可能少，每次停顿需将样品于-20℃保存；⑦对每一步纯化后的产品纯度、提纯倍数和回收率等应当详细记载，每经过一步分离提取方法后必须计算总蛋白含量和目标蛋白含量或效价，以便计算得率。

（3）产品质量的要求　①动物产品纯度一般要求在98%甚至99%以上，检验产品纯度可以用HPLC和SDSPAGE方法进行；②产品生物活性的测定必须采用国际上通用的测定方法，并用国际或国家标准品进行校正，以国际单位报道测定结果；③每一产品都有一定的比活力，如果比活力发生变化，通常该产品结构发生了变化；④基因工程产品是否糖基化、与其核酸序列是否一致会影响该产品的免疫原性、半衰期等，必须对产品的性质进行鉴定，包括相对分子质量、等电点、紫外吸收特性、氨基酸序列及组成、免疫印迹试验等；⑤产品在-20℃、4℃、25℃和37℃保存时，要定期检测其生理活性。

1.查资料，讨论动物细胞产品质量控制的主要内容。

2.如何计算t-PA的纯度、回收率、得率？

3.详细讨论t-PA性质鉴定方法及步骤。

t-PA的分离纯化与质量监控方案优化

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