构建优化重组载体方案

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：载体构建好后，有四种方法可以将重组载体导入动物细胞，即融合法、化学法、物理法和病毒法，其中使用最普遍的是磷酸钙沉淀法和电穿孔法。

一、目的基因的获得

真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小一部分（10-7～10-5），即使多拷贝基因也只有10-5，因此来源于真核细胞的产生基因工程药物的基因直接分离相当困难。在真核基因内一般有内含子，如果以原核生物细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，也无法表达出准确的基因产物。分离真核基因的方法很多，如反转录法、反转录-聚合酶反应法、化学合成法、编码序列富集法等。如果有含有目的基因的载体，可以直接通过PCR或酶切的方法获得目的基因。

1.确定需要哪些仪器设备及药品。

2.设计实训获得组织型纤溶酶原激活剂基因。

二、载体的构建及导入

当前被用以构建工程细胞的动物细胞有CHOK1、BHK-21、Namalwa、Vero等细胞和多种骨髓瘤细胞。在动物细胞内表达外源基因一般有两类表达载体：一类是病毒载体，如腺病毒、牛痘病毒、反转录病毒和杆状病毒；另一类是质粒载体，这类载体通常是穿梭载体，即在细菌和哺乳动物细胞体内均能增殖。这些载体必须包含：①在细菌体内复制的复制起点和抗性标记；②能使基因转录表达的调控元件；③用于筛选外源基因已整合的选择标记；④选择性增加拷贝数的扩增系统。

载体构建好后，有四种方法可以将重组载体导入动物细胞，即融合法、化学法、物理法和病毒法，其中使用最普遍的是磷酸钙沉淀法和电穿孔法。

1.确定构建CHO细胞表达载体需要哪些仪器设备及药品。

2.讨论腺病毒、牛痘病毒、反转录病毒和杆状病毒作为动物细胞表达载体的应用及其优缺点。

3.讨论构建质粒载体的必备元件。

4.讨论磷酸钙沉淀法和电穿孔法的原理。

5.制定构建载体并导入CHO细胞的详细实训方案并实施。

构建优化重组载体方案

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