重组α-干扰素的提取和分离优化

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：初级分离阶段的任务是分离细胞和培养液，破碎细胞和释放干扰素，浓缩产物和除去大部分杂质。（一）干扰素分离工艺过程菌体裂解用纯化水配制裂解缓冲液，置于冷室内，降温至2～10℃。采用盐浓度线性梯度5～50 mS/cm进行洗脱，配合SDS-PAGE收集干扰素峰，在2～10℃下进行。合并干扰素部分，最终蛋白质浓度应为0.1～0.2 mg/mL。无菌过滤分装用0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液，分装后，于-20℃以下的冰箱中保存。

初级分离阶段的任务是分离细胞和培养液，破碎细胞和释放干扰素（干扰素存在于细胞内），浓缩产物和除去大部分杂质。干扰素的纯化精制阶段是用各种高选择性手段（主要是各种色谱技术）将干扰素和各种杂质尽可能分开，使干扰素的纯度达到要求，最后制成成品。

（一）干扰素分离工艺过程

（1）菌体裂解　用纯化水配制裂解缓冲液，置于冷室内，降温至2～10℃。将-20℃冷冻的菌体破碎成2 cm以下的碎块，加入裂解缓冲液（pH7.5）中，2～10℃下搅拌2 h，利用冰冻复融分散将细胞完全破裂，释放干扰素蛋白。

（2）沉淀　向裂解液中加入聚乙烯亚胺，2～10℃下气动搅拌45 min，对菌体碎片进行絮凝。然后，向裂解液中加入乙酸钙溶液，2～10℃下气动搅拌15 min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。

（3）离心　在2～10℃下，将悬液在连续流离心机上16000 r/min离心，收集含有目标蛋白的上清液，细胞壁等杂质沉淀在121℃、30 min蒸汽灭菌后焚烧处理。

（4）盐析　将收集的上清液用4 mol/L硫酸铵进行盐析，2～10℃下搅匀后静置过夜。

（5）离心与储存　将盐析液在连续流离心机上16000 r/min离心，沉淀即为粗干扰素，放入聚乙烯瓶中，于4℃冰箱中保存（不得超过3个月）。

（二）干扰素纯化工艺过程

（1）配制纯化缓冲液　用超纯水配制0.02 mol/L磷酸缓冲液（pH7.5），配制完毕后经过0.45μm滤膜过滤，在百级层流下进行收集。超滤后，将缓冲液送到冷室，冷却至2～10℃。使用前应重新检查缓冲液的pH和电导值，确认无误后方可使用。

（2）溶解粗干扰素　在2～10℃下将粗干扰素倒入匀浆器中，加pH7.5磷酸缓冲液，匀浆，完全溶解。

（3）沉淀除杂质　待粗干扰素完全溶解后，用磷酸调节溶液pH至5.0，进行蛋白质等电点沉淀。

（4）离心　将悬液在连续流离心机上16000 r/min离心，收集上清液。

（5）疏水层析　用NaOH调节上清液pH至7.0，并用5 mol/L NaCl溶液调节电导值为180 mS/cm，上样，进行疏水层析，利用干扰素的疏水性进行吸附。在2～10℃下，用0.025 mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）和1.6 mol/L NaCl溶液进行冲洗，除去非疏水性蛋白，然后用0.01 mol/L磷酸缓冲液（pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液。

（6）沉淀、过滤　用磷酸调节洗脱液pH至4.5，调节洗脱液的电导值为40 mS/cm，搅拌均匀后2～10℃下静置过夜，进行等电点沉淀。然后进行过滤，在2～10℃下收集滤液。

（7）透析　调整溶液pH至8.0、电导值至5.0 mS/cm，通过截留相对分子质量为104的超滤膜，在2～10℃下，用0.005 mol/L缓冲液透析。

（8）阴离子交换层析　先用0.01 mol/L磷酸缓冲液（pH8.0）平衡DEAE阴离子交换树脂。上样后，用相同缓冲液洗涤。采用盐浓度线性梯度5～50 mS/cm进行洗脱，配合SDS-PAGE收集干扰素峰，在2～10℃下进行。

（9）浓缩和透析　合并阴离子交换层析洗脱的有效部分，调节溶液pH至5.0、电导值至5.0 mS/cm，在截留相对分子质量为104的超滤膜上，2～10℃下，用0.05 mol/L乙酸缓冲液（pH5.0）进行透析。

（10）阳离子交换层析　先用0.1 mol/L乙酸缓冲液（pH5.0）平衡CM阳离子交换树脂。上样后，用相同缓冲液洗涤。在2～10℃下，采用盐浓度线性梯度5～50 mS/cm进行洗脱，配合SDS-PAGE收集干扰素峰。

（11）浓缩　合并阳离子交换层析洗脱的有效部分，在2～10℃下，用截留相对分子质量为104的超滤膜进行浓缩，浓缩到1 L。

（12）凝胶过滤层析　使用Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析。先用含有0.15 mol/L NaCl的磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂，上样后，在2～10℃下，用相同缓冲液进行洗脱。合并干扰素部分，最终蛋白质浓度应为0.1～0.2 mg/mL。

（13）无菌过滤分装　用0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液，分装后，于-20℃以下的冰箱中保存。

（三）干扰素分离工艺过程控制要点

（1）使用保护剂　因为干扰素中的巯基极易被氧化形成二硫键，所以必须使用巯基试剂（如硫二乙醇）加以保护。金属离子是酶的激活剂和辅助因子，加入金属螯合剂EDTA可除去金属离子，从而抑制酶的活性。PMSF（苯甲基磺酰氟）是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂，加入PMSF保护目标产物以免被水解。

（2）使用絮凝剂　絮凝剂用量是重要的因素，在较低浓度下，增加用量有利于架桥作用，提高絮凝效果。但絮凝剂用量过多会吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层而失去与其他胶粒架桥的作用，造成胶粒再次稳定的现象，降低絮凝效果。过量的絮凝剂会将核酸包围起来，无法实现大范围架桥作用的沉淀，同时也会包裹一些目标产物，造成损失。高剪切力会打碎絮团，因此适当的搅拌时间和速度可以提高絮凝效果。加入絮凝剂时，注意不要使溶液中絮凝剂的浓度局部过高，否则会削弱沉淀的作用。

（3）使用凝聚剂　沉淀过程中加入乙酸钙产生凝聚作用。菌体及其碎片大多带负电，由于静电引力作用将溶液中带正电的粒子吸附在周围，形成双电层的结构，水化作用是胶体稳定存在的一个重要原因。加入乙酸钙的作用是破坏双电层和水化层，使粒子间的静电排斥力不足以抵抗范德华力而发生凝聚。

（四）干扰素纯化工艺过程控制要点

（1）膜分离　选择合适的截留相对分子质量滤膜很重要。超滤膜的孔径是平均孔径。一般来说，超滤膜的标准截留相对分子质量是指截留率在90%或95%时对应的相对分子质量，而且不同种类的蛋白质分子由于其空间形状不同，即使相对分子质量相同，截留率也不同。为了能将目标蛋白彻底截留下来，选择膜的截留相对分子质量应是目标产物的1/3～1/2。使用超滤膜过滤目标蛋白时，截留相对分子质量应该在目标蛋白相对分子质量的10倍以上。膜的截留率很高，但收率很低，主要是膜吸附作用造成的，所以应选择低吸附型的超滤膜。在使用超滤膜时，选用切向流滤器能避免浓差极化现象的产生。

（2）疏水性层析　在高电导的条件下上样层析，疏水性基团较多的目标蛋白与配基相互作用而被吸附，缺乏疏水基团的蛋白质首先被洗脱流出。然后降低洗脱液的电导性，使蛋白质的疏水性降低，目标蛋白就被从树脂上洗脱下来。疏水层析的控制点是缓冲液和上样液的pH和电导值。pH关系到蛋白质的活性，同时也影响其疏水性。电导值决定了蛋白质表现出的疏水性强弱，即与树脂的结合能力，所以电导值的准确尤为重要。

（3）离子交换层析　标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。离子交换层析时，先用离子强度较低的缓冲液上样和洗涤。由于不同种类的蛋白质与树脂的亲和力各不相同，可用逐渐增加洗脱液中氯化钠浓度的方法将其逐一洗脱出来。

离子交换层析的控制点主要是缓冲液和上样液的pH及电导值。如果pH和电导值不准确，能与离子交换剂结合的组分及各组分的结合能力会发生变化，给干扰素纯化造成困难。

（4）无菌灌装　无菌灌装是分离纯化工艺的最后一步，在整个干扰素生产过程中尤为重要。如果灌装中出现问题，可能导致前功尽弃。由于蛋白质产品不能高温灭菌，也不能接触消毒剂，所以原液采用0.22 μm滤膜过滤的方法除菌，过滤后分装至血浆瓶中，在-30℃的冰箱内冷冻保存。

1.制定详细的分离提取的工艺步骤并分离提取。

2.干扰素纯化过程中需要用到哪些缓冲液？如何配制？

3.如何选择膜、离子交换树脂？

重组α-干扰素的提取和分离优化

相关推荐