基因重组菌的高效发酵技术优化

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：图2-4-1干扰素α2b发酵工艺流程发酵罐培养将种子液通入装有300 L培养基的发酵罐中，接种量为10%，培养温度为30℃，pH为7.0。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。溶氧控制分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶氧浓度，以提高干扰素的发酵水平。温度控制工程菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。pH发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。

（一）干扰素发酵工艺过程

干扰素α2b发酵工艺流程如图2-4-1所示。

（1）菌种制备　取-70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后接入摇瓶，30℃、pH7.0、250 r/min活化培养（18±2）h后，进行吸光度测定和发酵液杂菌检查。

（2）种子罐培养　将已活化的菌种接入装有30 L培养基的种子罐中，接种量为10%，培养温度为30℃，pH为7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶氧为30%，培养3～4 h，当吸光度值达到4.0以上时，转入发酵罐中，进行二级放大培养，同时将发酵液取样鉴定。

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图2-4-1　干扰素α2b发酵工艺流程

（3）发酵罐培养　将种子液通入装有300 L培养基的发酵罐中，接种量为10%，培养温度为30℃，pH为7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶氧为30%，培养4h。然后控制培养温度为20℃，pH为6.0，溶氧为60%，继续培养5～6.5 h。同时进行发酵液杂菌检查，当吸光度值达8.0～10.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以延缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。

（4）菌体收集　将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于-20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。

（二）干扰素发酵工艺过程控制要点

在发酵生产工艺中，工程菌的生长和干扰素基因的表达时间不完全同步，可采用两段培养的策略进行过程控制。发酵工艺过程控制要点如下。

（1）培养基　使用不同的碳源和氮源对菌体生长和外源基因表达有较大影响。常用的碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。

发酵培养基配料（参考）：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.01%氯化铵、0.05%氯化钠、0.6%磷酸氢二钠、0.001%氯化钙、0.3%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁、0.4%葡萄糖、50 mg/mL氨苄青霉素、少量消泡剂。

（2）溶氧控制　分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶氧浓度，以提高干扰素的发酵水平。通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。

（3）温度控制　工程菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。产物合成温度控制在20℃可以有效防止α-干扰素的降解，而其最佳生长温度则为30℃。质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降，因此在培养后期降温可以减少目标产物的降解量，增加质粒的稳定性。

（4）pH　发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。α-干扰素的等电点在6.0附近，在弱酸性条件下稳定，能耐受pH为2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH，从而造成大量蛋白酶失活，减少α-干扰素的水解，提高干扰素的积累量。

1.根据所选工程菌株，配制培养基。

2.确定详细的发酵工艺，包括通气量、二阶段发酵温度、最适生长温度和pH、最适生产温度和pH、发酵时间、补料及消泡剂等，并进行操作。

基因重组菌的高效发酵技术优化

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