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基因克隆中的转化与阳性筛选

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：向管中加入1 mL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1 h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。（五）阳性克隆的筛选阳性克隆的筛选是指用PCR或酶切的方法对阳性克隆进行初步鉴定。阳性克隆经过初步鉴定后，需要对插入片段进行测序分析以确定其正确与否。菌液PCR：取10 μL菌液，加入含100μL水的Eppendorf管中，100℃煮沸20 min。取出10 μL煮沸后的溶液作为PCR的模板，进行菌液PCR。挑取单克隆，摇菌，提取质粒。

（一）确定基因工程表达系统

用于干扰素基因表达的宿主可分为两大类：原核细胞——大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌；真核细胞——酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。常见基因工程表达系统见表2-4-1。基因工程菌株选择原则如下：具备宿主细胞的特征和生产干扰素的能力，首先保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。

表2-4-1　大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞3类常见基因工程表达系统

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（二）受体菌的培养（以E.coli DH 5α为例）

从LB平板上挑取新活化的E.coli DH 5α单菌落，接种于3～5 mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养12 h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1∶（50～100）的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3 h至A600为0.5左右。

（三）制备感受态细胞（CaCl2法）

（1）CaCl2溶液配制：50 mL水中加入CaCl2粉末7.351 g。高压灭菌，4℃保存。

（2）取菌体培养液1 mL于1.5 mL微型管中。

（3）用冷冻离心机4℃下，1500 r/min离心5 min，弃上清液，沥干残液。

（4）在每个微型管中加入100μL冰中预冷的CaCl2溶液，轻晃悬浮菌体。

（5）用冷冻离心机4℃下，1500 r/min离心5 min，弃上清液，沥干残液。

（6）在每个微型管中加入100 μL冰中预冷的CaCl2溶液，轻晃悬浮菌体。-70℃冰箱保存备用。

（四）转化

（1）从-70℃冰箱中取200 μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上。

（2）加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50 ng，体积不超过10μL），轻轻摇匀，冰上放置30 min。

（3）42℃水浴中热击90 s或37℃水浴5 min，热击后迅速置于冰上冷却3～5 min。

（4）向管中加入1 mL LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1 h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。

（5）将上述菌液摇匀后取100 μL，涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24 h。待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

（6）4℃下放置数小时，使显色完全。

（五）阳性克隆的筛选

阳性克隆的筛选是指用PCR或酶切的方法对阳性克隆进行初步鉴定。PCR检测包括对菌液直接进行PCR检测或将转化菌落（重组子）扩大培养提取质粒后再进行PCR检测。阳性克隆经过初步鉴定后，需要对插入片段进行测序分析以确定其正确与否。

（1）菌液PCR：取10 μL菌液，加入含100μL水的Eppendorf管中，100℃煮沸20 min。取出10 μL煮沸后的溶液作为PCR的模板，进行菌液PCR。

（2）挑取单克隆，摇菌，提取质粒。酶切鉴定。测序分析。

（六）目的蛋白鉴定

保存的菌体可进一步用蛋白质提取方法提取蛋白质，经SDS-PAGE检测表达蛋白或进行Western印迹杂交分析。流程如下：SDS-PAGE电泳分离蛋白质；将蛋白质转印至膜上；封闭非特异性结合位点；膜与目的蛋白特异性抗体孵育；加入显色底物显色或与化学发光试剂孵育、曝光显影。

1.结合所查资料，确定使用哪一种基因工程表达系统。

2.确定如何构建基因工程菌并实施。

3.比较各种载体的优劣，选择合适的载体。

4.制备感受态细胞有哪些方法？分别如何制备？

5.筛选阳性克隆的方法和原理有哪些？确定一到两种筛选方法并实施。

6.目的蛋白鉴定的方法和原理有哪些？确定一到两种筛选方法并实施。

7.查找DNA测序的原理和方法。